Étude structure/fonction du site catalytique de la xylanase A de streptomyces lividans

Abstract

La xylanase A de Streptomyces lividans (XlnA) fait partie de la famille 10 des glycosyl hydrolases. Les domaines catalytiques des enzymes de la famille 10 possèdent une structure en motif (α/β)₈ appartenant au clan GH-A. Le site actif de ces xylanases est formé par les résidus situés sur les boucles qui font la liaison entre les hélices α et les brins β et contient les deux acides aminés catalytiques, un jouant le rôle de catalyseur acide/base et l'autre de nucléophile. Ces deux résidus ont été identifiés par mutagenèse dirigée et confirmés par l'obtention de la structure tridimensionnelle de la XlnA. La structure tertiaire a également permis l'identification des autres acides aminés et des interactions composant le site actif des enzymes de cette famille. L'objectif principal de ce projet s'inscrit dans le cadre de l'étude de la relation entre la structure et la fonction qui régie [i.e. régit] le site actif de la XlnA. En effet, certains acides aminés du site actif de la XlnA, conservés à travers les enzymes de la famille 10 et situés dans l'environnement immédiat des deux résidus catalytiques, ont été remplacés par mutagenèse dirigée. Les protéines mutantes ainsi produites et purifiées ont été caractérisées au niveau cinétique et structural. Les résultats obtenus ont montré d'une part, que l'asparagine 127, un des trois résidus conservés chez les enzymes du clan GH-A, est impliqué dans la stabilisation de l'intermédiaire catalytique dans le site actif de la XlnA. De plus, N127 joue un rôle important dans le maintien de l'état d'ionisation des deux résidus catalytiques. D'autre part, trois résidus histidine conservés dans la famille 10 des glycosyl hydrolases et situés dans le site actif de la XlnA ont été étudiés. Les résultats ont révélé que H81 et H207 sont impliqués à différents niveaux dans la structure et la fonction de l'enzyme. Il a été démontré que ces deux acides aminés sont très importants pour l'activité enzymatique et pour la stabilité de la protéine. De plus, tout comme N127, ils sont impliqués dans le maintien de l'état d'ionisation des deux résidus catalytiques. Par ailleurs, d'autres résultats obtenus indiquent que l'histidine 86 a été conservé dans la famille 10 pour son importance au niveau structural. Cet acide aminé du site actif est important pour la stabilité de la protéine et est également impliqué dans le maintien du pK_a élevé du catalyseur acide/base. Cette étude des relations qui existent entre la structure et la fonction du site actif de la XlnA ont permis d'approfondir nos connaissances quant à l'importance des interactions nécessaires au bon fonctionnement des enzymes ayant ce type de repliement. Cet ensemble d'interactions qui forment le site actif des enzymes est indispensable pour la stabilité de leur structure autant que pour leurs propriétés enzymatiques. Ces résultats ont permis d'élucider le rôle individuel joué par chacun des acides aminés étudiés et de mettre en évidence l'importance de leur intégrité au sein du site actif de l'enzyme.