Détection par PCR en temps réel du groupe Bacillus cereus et identification de Bacillus anthracis dans les produits alimentaires

Abstract

Le groupe Bacillus cereus comprend les espèces suivantes: B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B anthracis, B. pseudomycoides et B. weinhenstephanensis . Les membres de ce groupe sont phénotypiquement et génétiquement très proches et ils ont tous été associés à des cas de maladies chez les humains. Pour la détection des bacilles du type cereus, les méthodes de référence utilisent des protocoles de sélection et de différenciation microbiologique. Ces méthodes s'échelonnent sur plusieurs jours pour identifier les bacilles et éprouvent une certaine difficulté pour une identification précise des espèces. Depuis plusieurs années, des outils de détection basées sur la biologie moléculaire remplacent les méthodes traditionnelles microbiologiques. Ces techniques sont plus rapides et souvent plus précises que les méthodes de référence. En particulier, les techniques qui utilisent l'amplification en chaîne par polymérase (PCR) sont de plus en plus reconnues pour leur précision et leur rapidité. Dans le cadre de ce projet, quatre méthodes de détection et de quantification des bacilles du groupe cereus ont été développées. Chaque méthode utilise la PCR pour identifier la présence d'ADN cible. Deux des méthodes utilisent la PCR en temps réel pour quantifier le niveau de contamination. Cependant, il faut noter que ces méthodes ne peuvent détecter un faible niveau de contamination et que certains aliments inhibent la réaction elle-même. La troisième méthode utilise la technique statistique du nombre le plus probable pour quantifier de faibles niveaux de contaminations. Cette méthode est la plus complexe à exécuter, toutefois elle permet une quantification avec ces niveaux de contamination faibles et sur des matrices qui peuvent être difficiles à analyser. La dernière méthode consiste à un enrichissement de la totalité de l'échantillon dans un bouillon de culture, suivi de la PCR. Cette méthode permet la détection de toute contamination, même d'une seule bactérie par échantillon, mais la méthode ne permet pas de quantifier le niveau de contamination. Chaque méthode remplit un rôle spécifique et le choix de la technique varie selon la situation. Parmi les espèces du groupe B. cereus, B. anthracis est particulièrement pathogénique, causant le charbon bactéridien ou «anthrax». Historiquement, on confère une grande importance à cette maladie puisqu'elle fut un grand fléau pour l'agriculture et qu'elle est considérée responsable de plusieurs pestes historiques. Depuis une cinquantaine d'années, le charbon bactérien a été bien contrôlé dans les pays développés, mais en 2001 la bactérie a été utilisée pour des attentats terroristes aux États-Unis. Depuis, cette bactérie est redevenue un pathogène sous haute surveillance. Les bactéries de l'espèce B. anthracis se différencient des autres du groupe B. cereus par leur virulence, elles possèdent deux plasmides qui codent pour des gènes de virulence responsables pour l'extrême toxicité de ces bactéries. Toutefois, on trouve des exceptions dans la nature, des souches de B. anthracis qui ne possèdent aucun ou seulement un des plasmides, ce qui les rend beaucoup moins pathogéniques ainsi que des souches de B. cereus, qui possèdent un plasmide très similaire et sont beaucoup plus pathogéniques. Trois marqueurs moléculaires permettant l'identification et la caractérisation de la virulence de B. anthracis ont été développés. Un marqueur pour l'ADN chromosomique fut développé en comparant les séquences de quatre génomes de B. anthracis avec trois génomes de B. cereus et un génome de B. thuringiensis . Aussi, un marqueur pour chaque plasmide a été développé en ciblant les gènes situés sur les plasmides de virulence. La spécificité des marqueurs développés a été démontrée suit à une validation réalisée avec des souches de B. anthracis.