Production de chitosanases modulaires munies d'un site d'attachement à la cellulose et étude de leur activité en bioréacteur

Abstract

Cinq gènes de fusion ont été crées par manipulations génétiques. Ces gènes codent pour des chitosanases modulaires munies d'un domaine d'attachement à la cellulose. Ces cinq gènes ont été nommés csn-g-xbd, csn-g-cbd[indice inférieur Cex], csn-pt-cbd[indice inférieur Cex, csn-neg-cbd[indice inférieur Cex et csn-pos-cbd[indice inférieur Cex. Tous ces gènes, de même que le gène csn-cbd[indice inférieur Cex obtenu lors de travaux précédents, ont été exprimés dans l'actinomycète Streptomyces lividans TK24. L'analyse des protéines extracellulaires produites par les sources transformées démontre que les gènes de fusion sont exprimés par S. lividans mais la majorité (environ 60 a 99%) des peptides produits ont une masse moléculaire apparente (évaluée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS dénaturant) comparable à la masse du module catalytique CSN seul. Il est donc suggéré que les enzymes modulaires sont clivées sous l'action des protéases endogènes du microorganisme producteur. L'expression des gènes csn-g-xbd et csn-cbd[indice inférieur Cex] a mené aux meilleurs taux de production d'enzymes de fusion dont la masse apparente est voisine de la masse attendue pour ces enzymes dans leur forme complète. Malgré une faible production d'enzymes modulaires intactes, ces dernières ont pu être immobilisées par simple contact des surnageants de cultures avec de la cellulose microcristalline. L'activité des enzymes immobilisées a été étudiée à l'intérieur de bioréacteurs de type colonne (ou à lit fluidisé) utilisés en continu. Il a été observé que toutes les enzymes, une fois immobilisées, demeurent actives sur le chitosane de haut poids moléculaires en solution. Il a aussi été observé que le degré d'hydrolyse varie en fonction du débit de la solution de chitosane à travers les bioréacteurs. Aucune fuite d'enzyme n'a pu être détectée lors de l'utilisation des bioréacteurs. L'inactivation des enzymes immobilisées suit une cinétique exponentielle. Des demi-vies de l'ordre de dizaines de jours ont été observées à 37[degrés]C pour les enzymes CSN-G-XBD, CSN-CBD[indice inférieur Cex] et CSN-PT-CBD[indice inférieur Cex]. Des essais à 45[degrés]C ont montré des demi-vies de l'ordre de quelques jours pour les enzymes CSN-PT-CBD[indice inférieur Cex] et CSN-G-CBD[indice inférieur Cex]. Ces résultats ont permis de prouver la faisabilité technique d'un procédé d'hydrolyse du chitosane à l'aide de chitosanases modulaires immobilisées.