Analyse des déterminants moléculaires des voies de signalisation du récepteur UT de l'urotensine II

Abstract

L'urotensine II (UII) est un peptide cyclique de 11 résidus décrit à ce jour comme le plus puissant vasoconstricteur connu. L'UII exerce ses fonctions en liant et en activant le récepteur UT, un GPCR couplé à la protéine G[alpha][indice inférieur q/11]. Nous avons montré que l'activation du récepteur UT par son agoniste UII promeut l'internalisation du récepteur dans des cellules COS-7 et HEK-293. Cette internalisation s'effectue principalement via les vésicules tapissées de clathrine. L'utilisation d'un récepteur UT conjugué à la protéine GFP et d'arrestines fonctionnelles conjuguées à la protéine fluorescente YFP a montré, par microscopie confocale, que l'activation du récepteur UT mène à son internalisation dans de larges vésicules intracellulaires et à sa co-localisation avec la [bêta]-arrestine1 et la [bêta]-arrestine2. Afin de déterminer l'importance de la portion carboxy-terminale dans la signalisation et l'internalisation du récepteur UT, nous avons produit plusieurs mutants de délétion de la queue carboxy-terminale ainsi qu'un mutant où un groupe de quatre sérines adjacentes ont été remplacées par des alanines. Ces constructions nous ont permis de montrer que la délétion des 50 derniers résidus n'affecte pas la capacité du récepteur UT à signaler via la protéine G[alpha][indice inférieur q/11] ainsi que vers la voie des ERKs. Nous avons finalement montré l'importance du groupe de sérines, situé dans la portion distale de la queue carboxy-terminale du récepteur UT, afin de promouvoir une internalisation efficace d'UT lors de son activation par son agoniste UII. Dans la seconde partie du projet de recherche, nous avons examiné le rôle du résidu D97[indice supérieur 2.50] ainsi que des résidus E147[indice supérieur 3.49], R148[indice supérieur 3.50] et Y149[indice supérieur 3.51] du motif ERY dans la fonctionnalité du récepteur UT. Les mutations D97[indice supérieur 2.50]A, R148[indice supérieur 3.50]A et R148[indice supérieur 3.50]H ont aboli la capacité du récepteur UT à activer la PLC alors que les mutations E147[indice supérieur 3.49] et Y149[indice supérieur 3.51] ont diminué de 50% la capacité à activer la PLC. Aucun des mutants n'a démontré d'activité constitutive. Cependant, les mutants R148[indice supérieur 3.50]A et R148[indice supérieur 3.50]H ont activé les protéines ERKs, ce qui a été aboli par l'agent AG1478, un inhibiteur de l'activité kinase du récepteur à l'EGF. Chacun de ces deux mutants est capable d'activer directement le récepteur à l'EGF ce qui démontre qu'ils activent la voie des ERKs par un mécanisme indépendant de la protéine G[alpha][indice inférieur q/11], mais dépendant de la transactivation du récepteur à l'EGF. Les mutants D97[indice supérieur 2.50]A, R148[indice supérieur 3.50]A et R148[indice supérieur 3.50]H n'internalisent pas et ne colocalisent pas avec la [bêta]-arrestine2 lors de leur activation par l'UII. Finalement, l'internalisation du mutant E147[indice supérieur 3.49]A a été significativement plus importante que celle du récepteur type-sauvage. Cette deuxième étude souligne la contribution majeure du résidu conservé D97[indice supérieur 2.50] dans la fonctionnalité d'UT et le rôle central joué par le résidu R[indice supérieur 3.50] dans la signalisation protéine G-dépendante ou -indépendante.