Caractérisation des propriétés biochimiques de serpines modifiées ciblant la furine

Abstract

L'[alpha][indice inférieur 1]-antitrypsine ([alpha][indice inférieur 1]-AT), un inhibiteur naturel de l'élastase, et l'[alpha][indice inférieur 1]-antichymotrypsine ([alpha][indice inférieur 1]-ACT) appartiennent à la superfamille des serpines, qui sont des inhibiteurs irréversibles de sérines protéinases. Nous avons développé une approche qui consiste à modifier la boucle du site réactif de ces serpines afin de cibler diverses sérines protéinases impliquées dans le clivage de précurseurs protéiques (furine) ou de protéines de la matrice extracellulaires (élastase). La furine est une sérine protéinase Ca[indice supérieur 2+]-dépendante appartenant à la famille des convertases de mammifères de type subtilisine/kexine. Elle réside principalement dans le réseau du trans-Golgi (TGN) de la voie de sécrétion constitutive, mais elle peut aussi se retrouver à la surface cellulaire. À partir de la spécificité de la furine qui reconnaît principalement des paires ou plusieurs acides aminés basiques d'une séquence donnée, nous avons construit une série de variants d'[alpha][indice inférieur 1]-AT et d'[alpha][indice inférieur 1]-ACT contenant différents motifs de reconnaissance pour la furine afin d'augmenter l'affinité et leur pouvoir inhibiteur envers cette convertase. De plus, nous avons aussi développé une méthode qui consiste à conjuguer chimiquement sur une cystéine de l'[alpha][indice inférieur 1]-AT recombinante un polyéthylène glycol (PEG) afin d'augmenter sa stabilité lors des études in vivo. Les résultats montrent que la boucle du site réactif de l'[alpha][indice inférieur 1]-AT peut être aisément modifiée en un inhibiteur irréversible de la furine, comme l'[alpha][indice inférieur 1]-AT-PDX, sans compromettre les propriétés inhibitrices essentielles de la serpine originale. Les divers variants de la boucle du site réactif de l'[alpha][indice inférieur 1]-AT et l'[alpha][indice inférieur 1]-ACT ont montré tous une capacité de former des complexes SDS-stables avec des stoechiométries d'inhibitions (SI) variables in vitro et d'abolir la maturation protéolytique du précurseur du facteur von Willebrand par la furine in cellulo. Toutefois, l'insertion de résidus basiques dans la région réactive de l'[alpha][indice inférieur 1]-AT et l'[alpha][indice inférieur 1]-ACT à des positions stratégiques a affecté l'ensemble des propriétés inhibiteurs de type serpine de certains variants. La reconnaissance de motifs canoniques furine (e.g. RXXR) par la furine est pH indépendante, alors que l'étape de déacylation est dépendante du pH, comme montré par AT-EK2. Par contre, les variants [alpha][indice inférieur 1]-ACT sont plus efficaces à former un complexe à pH acide alors que les variants [alpha][indice inférieur 1]-AT le sont à pH basiques. De plus, la conjugaison au PEG de l'[alpha][indice inférieur 1]-AT recombinante a permis de prolonger sa demie-vie dans le poumon et le sang et de contrecarrer les effets hémorragiques causés par l'élastase leucocytaire dans le poumon des souris. Étant donné que la farine est responsable de l'activation de plusieurs précurseurs protéiques bactériens, tel que l'anthrax, et les glycoprotéines virales, tel que le virus d'Ebola, ces inhibiteurs anti-furine contenant des séquences de résidus basiques déterminées pourraient potentiellement être utilisés pour combattre ces infections pathogènes. De plus, ils permettraient de contrecarrer l'acuité des effets de morbidité causés par des pathogènes opportunistes dans certaines maladies du système respiratoire (emphysème et fibrose kystique).