Identification des déterminants moléculaires composant la pochette de liaison de GPCRS à ligands peptidiques par marquage par photoaffinité et par la méthode "SCAM"

Abstract

Afin d'identifier les résidus formant la pochette de liaison du récepteur AT[indice inférieur 1] de l'angiotensine II (AngII), nous avons tout d'abord utilisé la méthode de marquage par photoaffinité. Pour ce faire, nous avons développé des analogues photosensibles de l'AngII soit le [Bpa[indice supérieur 1]]AngII, le [Bpa[indice supérieur 3]]AngII et le [Bpa[indice supérieur 8]]AngII. À l'aide des analogues radiomarqués avec de l'iode 125, nous avons photomarqué spécifiquement le récepteur AT[indice inférieur 1] exprimé dans des cellules COS-7. Afin de circonscrire le site de contact pour chacun des analogues, nous avons soumis les complexes ligand-récepteur à des digestions chimiques et enzymatiques. L'analyse des fragments obtenus nous a permis de déterminer que le site de contact des analogues [indice supérieur 125] I-[Bpa[indice supérieur 1]]AngII et [indice supérieur 125] I-[Sar[indice supérieur 1],Bpa[indice supérieur 3]]AngII se trouve essentiellement dans la 2e boucle extracellulaire du récepteur alors que le [indice supérieur 125] I-[Sar[indice supérieur 1],Bpa[indice supérieur 8]]AngII fait contact avec le 7e domaine transmembranaire (TM7). Ensuite, nous avons utilisé la méthode de marquage par photoaffinité dans le contexte du récepteur de l'urotensine II (UII), le GPR14. Ainsi l'analogue de l'UII, le [indice supérieur 125] I-[Bpa[indice supérieur 6]]UII a permis de photomarquer spécifiquement le GPR14. L'analyse du patron des digestions chimiques et enzymatiques du GPR14 photomarqué, nous a permis de déterminer que le site de contact de cet analogue se trouve dans le TM4 du GPR14. Dans un deuxième temps, afin de déterminer l'orientation du TM7 du récepteur AT[indice inférieur 1] dans la pochette de liaison, nous avons utilisé la méthode de SCAM (Substituted-Cysteine Accessibility Method). Les résidus lle276 à Tyr302 du récepteur AT[indice inférieur 1] ont été substitués par des cystéines (Cys) par mutagenèse dirigée. Les récepteurs mutants ont été traités avec le MTSEA, un réactif modifiant les Cys exposées à un milieu aqueux. Ainsi, une modification des Cys exposées à la pochette de liaison va altérer la liaison du ligand au récepteur. Le traitement du récepteur AT[indice inférieur 1] natif avec le MTSEA n'a pas affecté la liaison de l'antagoniste peptidique [indice supérieur 125] I-[Sar[indice supérieur 1]-lle[indice supérieur 8]]AngII, ce qui suggère que les Cys endogènes ne sont pas exposées à la pochette de liaison. Le MTSEA a altéré la liaison de l'antagoniste aux récepteurs A277C, V280C, T282C, A283C, 1286C, A291C et F301C ce qui supporte la localisation de ces résidus dans la pochette de liaison."--Résumé abrégé par UMI.