Caractérisation, rôle et purification d'un canal chlore des muscles lisses de trachée

Abstract

Cette étude visait à caractériser une conductance Cl - présente dans les muscles lisses des voies aériennes (MLVA) de bovins, de façon à étudier les propriétés biophysiques du courant unitaire produit, puis à purifier la protéine formant ce canal pour en définir les propriétés biochimiques. Le premier objectif spécifique était d'incorporer des canaux Cl - unitaires suite à la fusion de microvésicules dérivés de cellules MLVA dans des bicouches lipidiques planes, afin d'en révéler les caractéristiques unitaires. En présence de 250/50 mM CsCl cis / trans , nous avons mis en évidence un canal de conductance unitaire intermédiaire (77 pS), présentant une relation courant-voltage ohmique. L'ordre de sélectivité du canal Cl- > I- > Br- > F- >> SO[indice inférieur 4] [indice supérieur 2-] suggère une bonne sélectivité pour les anions monovalents de la famille des halogènes. Dans nos conditions expérimentales, la probabilité d'ouverture (Po) du canal est élevée (>0.75) et insensible aux variations de potentiels dans la gamme testée («60 mV), aux variations de [Ca[indice supérieur 2+] ] du côté cytoplasmique et au pH. Les kinases PKA, PKG et PKC, ainsi que les composantes de cocktails de phosphorylation (AMPc, ATP, GMPc, GTP) n'ont pas d'effet sur le canai reconstitué. Le second objectif visait à mettre en évidence les mécanismes modulant l'activité du canal. Nous avons découvert que les acides époxyeïcosatrïénoïques (EET) produits par la cytochrome P-450 monooxygénase modulent l'activité du canal reconstitué. Deux des régioisomères (le 5,6- et le 8,9-EET) causent une inhibition combinant des diminutions concentration-dépendantes de la conductance unitaire et de la Po des canaux (IC[indice inférieur 50] respectifs: 0.3 et 0.4 [mu]M). L'apport des conductances ioniques sarcolemmales au maintien du potentiel membranaire a fait l'objet de mesures effectuées à l'aide de microélectrodes de haute résistance empalées dans des MLVA de lapins. Le rôle du canal au niveau cellulaire a été interrogé par cette technique. Les EETs induisent une hyperpolarisation de quelques mV des cellules, qui est reproduite par l'ajout de l'inhibiteur de canaux Cl - DIDS, et donc partiellement attribuable à l'inhibition des canaux Cl - et. Le troisième objectif visait à purifier le canal caractérisé, afin d'évaluer ses propriétés biochimiques. La reconstitution après différentes étapes de purification d'un courant Cl - identique à celui généré par la protéine native suggère une structure monomérique capable de transporter du Cl - indépendamment des autres composantes cellulaires. L'analyse par immuno-buvardage à l'aide d'anti-CLC-3 suggère que le canal a une masse moléculaire de ~55 kDa."--Résumé abrégé par UMI.