Étude de la région riche en résidus cystéine de la convertase de mammifère humaine SPC1/furine

Abstract

SPC1/furine est une protéase à sérine dépendante du Ca[exposant]++ membre de la famille des convertases de mammifère et responsable de la maturation de plusieurs précurseurs protéiques tels pro-ADAMTSI, gp160 du HIV-1 et la pro-fibrilline. Un de ses domaines, la région riche en résidus cystéine (RRC), n'a pas de fonction connue. Trois approches furent utilisées afin d'élucider le rôle de la RRC. (1) L'expression de SPC1 dans un modèle de cellules d'insectes et la caractérisation enzymatique de deux formes tronquées, avec et sans RRC, a permis d'établir que la RRC n'a aucune influence sur les paramètres cinétiques de l'enzyme. Cependant, la RRC permet de stabiliser l'enzyme lui permettant d'être active 3 fois plus longtemps. (2) L'importance de la RRC dans la biosynthèse de SPC1 fut étudiée à l'aide de mutants de délétion et de protéines chimériques SPC1 et SPC4. L'expression dans les cellules 293 et l'analyse par marquage métabolique et immunoprécipitation permet [i.e. permettent] d'établir que, contrairement à SPC4, la RRC n'influence pas la biosynthèse de SPC1. La délétion de la RRC de SPC4 diminue l'efficacité d'autoactivation de l'enzyme; l'échange de la RRC de SPC4 par celle de SPC1 ne permet pas de rétablir l'activation efficace de SPC4 suggérant que chaque RRC est spécifique à son enzyme. Enfin, lorsque la RRC de SPC4 est greffée à SPC1 la protéine chimérique se retrouve dans des corps d'inclusion. (3) La RRC de SPC1 est homologue à celle de TNFRI/II. Des mutations dans cette région de TNFRI sont à l'origine du syndrome familial de fièvre épisodique. Des mutations similaires de SPC1 (C614Y/C641F) causent, tout comme pour TNFRI, une diminution marquée du largage. L'étude cinétique montre que le largage est le mécanisme utilisé par les cellules 293 pour réguler le niveau de SPC1 membranaire. Des études avec des inhibiteurs de protéases, agent acidotropiques et la biotinylation des protéines de surface montrent que le largage est fait par une protéase à sérine dépendante du Ca[exposant]++ et a lieu dans la voie endosomale. Finalement, le site de largage a été délimité aux résidus 683-687 de SPC1.