Caractérisation des épitopes immunodominants et des régions 3' non-codantes de la calpastatine, un autoantigène ciblé dans la polyarthrite rhumatoïde

Abstract

La participation des protéases à la régénération du cartilage est un processus connu, mais le déséquilibre entre ces protéases et leurs inhibiteurs, en faveur des premier [i.e. premiers], peut amener une condition pathologique. Cette étude consiste à localiser dans la séquence peptidique de la calpastatine les peptides responsables de sa reconnaissance par les sérums de patients atteints par la polyarthrite rhumatoïde (PR) et le lupus érythémateux disséminé (LED). Les sérums de 100 patients ont été testés sur les divers domaines de la calpastatine afin de parvenir à localiser le domaine immunodominant. Les sérums de 82,5% (33/40) des patients rhumatoïdes ont détecté la calpastatine. 12,5% des sérums sont positifs uniquement pour le domaine 4, alors que 22,5% le sont pour le domaine 2 et 47,5% pour les deux domaines conjointement. Chez les lupiques, le nombre total de sérums positifs pour la calpastatine est de 34,5% (10/29), dont un réagit uniquement avec le domaine 4, 5 sérums réagissent avec le domaine 2 et 4 autres avec les deux domaines. Seulement 3 des 31 sérums normaux ont réagi avec la calpastatine, dont un avec le domaine L, deux avec le domaine 4, et aucun avec le domaine 2. Pour déterminer le ou les épitopes responsables de la réactivité des auto-anticorps avec Ia calpastatine, nous avons synthétisé des peptides dans les domaines 2 et 4. Parmis [i.e. Parmi] les sérums PR testés, 16 des 23 sérums (69,5%) D4 positifs ont réagi avec deux épitopes C-terminaux en position 673-684 et 697-708. Seulement 6 des 25 sérums D2 positifs ont réagi avec divers peptides. Nous avons aussi testé l'activité catalytique de la calpaïne de type II et l'activité inhibitrice de nos protéines recombinantes correspondantes à chacun des domaines de la calpastatine. Nous avons ainsi déterminé la hiérarchie suivante: RA1 >>> D1 > DL2 > D3 > D4 > D2, RA1 étant le plus inhibiteur et D2 le moins inhibiteur. En plus, des essais préliminaires suggèrent que Ies IgGs purifiés de sérums PR positifs aux domaines 2 et 4 interfèrent dans l'inhibition de la calpaïne par la calpastatine. Cela suggère l'implication des anticorps anticalpastatine dans la pathologie de la polyarthrite rhumatoïde. Suite au criblage de la librairie d'expression de placenta humain dans le vecteur [lambda]gt11 avec une sonde ADNc de calpastatine correspondent aux domaines 3 et 4, nous avons identifié deux nouvelles régions 3' non-codantes différentes. Afin de prouver l'appartenance de ces régions 3' noncodantes au génome et aux messagers de la calpastatine, nous avons procédé à plusieurs analyses moléculaires. Ainsi, nous avons hybridé des membranes contenant les ARN poly A de 16 tissus humains avec une sonde représentant la région codante, et deux autres dans les régions 3' non-codantes. Nos résultats ont démontré que la calpastatine est ubiquitaire et qu'il existe deux ARNm principaux à 4.9 kb et à 3.3 kb. En plus, les régions 3' non-codante de la calpastatine sont différentiellement exprimées dans les tissus testés. Nous avons aussi démontré la présence de ces régions 3' non-codantes par RT-PCR dans les cellules HeLa, les ostéoblastes et le placenta humain, avec une prédominance de la région 3' non-codantes de type RA 1.6. Cependant les protéines recombinantes exprimées à partir des ADNc de RA1.2 et RA1.6 ne réagissent pas différemment sur le plan immunologique avec les sérums des patients.