Caractérisation des interactions impliquant les ribonucléoprotéines Ro humaines et leurs partenaires cellulaires

Abstract

Les ribonucléoprotéines Ro (RNP Ro) humaines sont des complexes autoantigéniques composés d'un des quatre ARN hY (1,3,4 ou 5), associé à une protéine de 60 kDa nommée Ro60. La protéine Ro60 s'associe aux ARN hY via une double hélice formée par l'appariement entre les extrémités 5' et 3' de l'ARN hY. Une seconde protéine de 48 kDa nommée La s'associe à une fraction des RNP Ro. L'interaction entre la protéine La et les RNP Ro se fait au niveau de la queue polyuridylée des ARN hY. Les ARN hY sont transcrits par YARN polymérase III et n'encodent aucune protéine. À ce jour, les fonctions cellulaires des RNP Ro sont encore inconnues. Les autoanticorps anti-Ro RNP sont les plus fréquents anti-RNP développés par les gens souffrant de maladies du tissu conjonctif. Ils sont par conséquent des marqueurs sérologiques communs utilisés pour dépister certaines formes de lupus, de même que le Syndrôme de Sjögren (SjS). L'implication de ces autoanticorps au niveau pathologique est encore très mal comprise. On ne sait toujours pas s'ils ont un rôle pathologique ou s'ils ne sont que le produit dune cascade autoimmune. Un obstacle majeur à la compréhension de leur implication pathologique est l'absence de fonction cellulaire associée aux RNP Ro. Il est donc important de déterminer les fonctions cellulaires des RNPs Ro de manière à éclaircir le mécanisme de développement et d'action des autoanticorps anti-Ro RNP. Afire de définir les fonctions cellulaires des RNP Ro humaines, nous avons mis au point un système d'étude des interactions prenant place à l'intérieur de RNP composées d'au mois deux protéines et d'un ARN. Ce système nommé RNP Interaction Trap Assay (RITA) utilise des bases similaires au système double-hybride utilisant comme hôte la levure Saccharomyces cerevisiae . Nous avons d'abord utilisé ce système pour confirmer l'absence d'interaction entre la protéine Ro52 et les différentes composantes des RNP Ro humaines. Nous avons par la suite utilisé ce système pour cribler une bibliothèque d'expression d'ADNc humains en utilisant comme"appât" un complexe ribonucléoprotéique formé de la protéine Ro60 humaine associée à l'ARN hYS. Des 226 clones repêchés, 11.5% encodaient la protéine La, alors que 59% encodaient un nouveau membre de la famille des protéines liant l'ARN, que nous avons nommé Ro Binding protein I (RoBP1). RoBP1 contient 559 acides aminés, et a un poids moléculaire prédit de 60 kDa. RoBP1 migre toutefois sur un gel dénaturant SDS-PAGE à environ 65 kDa. Deux variants alternatifs ont été identifiés par RT-PCR: un variant de 542 acides aminés, et un autre de 530 acides aminés. Des études de reconstruction utilisant la banque de données dbEST de souris (National Center for Biotechnology Information (NCBI)) ont permis de reconstruire l'homologue murin de la RoBP1 à partir de fragments de séquences d'ADNc de souris, démontrant une homologie de plus de 95% entre les formes marine et humaine. Des études de Northern blot sur l'ARNm isolé de 16 tissus humains différents ont démontré que l'ARNm de la RoBP1 était présent dans tous les types de tissus testés. Des études d'immunobuvardage sur des extraits cellulaires HeLa énuclées ont également démontré que la protéine RoBP1 était répartie à des proportions équivalentes entre le noyau et le cytoplasme. Enfin, des études d'immunoprécipitation anti-Ro et anti-Ro/La sur des extraits cellulaires réticulés au [3,3'-Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate)] (DTSSP) ont démontré qu'une faible fraction des RNP Ro humaines était située à proximité (moins de 12 êA) de la RoBP1. Nous croyons que l'utilisation de ce nouvel outil (RITA), ainsi que l'identification de la RoBP1 serviront à mieux comprendre les fonctions cellulaires des RNP Ro.