Mécanismes modulant l'épissage alternatif du pré-mRNA de la NCAM murine

Abstract

L'exon E18 du pré-mRNA de la NCAM murine est épissé alternativement. Afin de déterminer les facteurs en cis et en trans impliqués dans cet épissage alternatif, un système in vitro a été mis au point. Ce système a permis d'observer une régulation histo-spécifique de l'utilisation du site d'épissage 5 ' et du site d'épissage 3 ' de E18 et ce, en absence de la majorité des séquences de E18 et des introns flanquants. L'utilisation d'un substrat d'épissage renfermant seulement l'unité d'épissage E18-E19 réduite à une taille minimale a permis de mettre en évidence un appariement de bases entre les positions +5 et +8 du site d'épissage 5 ' de E18 et -30 à -33 en amont du site d'épissage 3 ' de E19. De plus, lorsque testées dans le contexte d'un pré-mRNA contenant les sites d'épissage 5 ' de E17 et de E18 en compétition pour le site d'épissage 3 ' de E19, des mutations en amont du site de branchement majeur (aux positions -32 et -33) favorisent l'épissage E18/E19 dans des extraits NIH3T3. Des mutations compensatoires introduites aux positions +7 et +8 du site d'épissage 5 ' de E18 neutralisent l'effet des mutations au site de branchement et défavorisent l'épissage E18/E19. L'ensemble des résultats présentés suggèrent donc que la structure se forme de façon précoce et interfère avec l'assemblage de complexes initiés au site d'épissage 5 ' de E18. Ce nouveau type d'interaction intronique pourrait exister dans d'autres pré-mRNAs eucaryotes. Une délétion de 61 nt dans l'exon constitutif E17 entraîne une stimulation de l'inclusion de E18 in vivo dans les cellules neuronales N2a. L'utilisation du système in vitro a permis de montrer que cet élément agit de façon positive sur la sélection du site d'épissage 5 ' de E17. Des protéines SR purifiées lient des séquences dans E17 et font partie d'un complexe se formant spécifiquement sur l'élément dans des extraits neuronaux. Des expériences de compétition supportent un modèle dans lequel la liaison des protéines SR à l'exon E17 assure qu'un niveau adéquat de messagers ne contenant pas E18 soit produit dans les cellules d'origine neuronale. D'un autre côté, l'absence de formation de complexes sur E17 dans les extraits NIH373 suggère que l'épissage E17/E19 se fait par défaut dans les fibroblastes et ne requière [i.e. requiert] aucune stimulation.