The sodium background currents in cultured neonatal rat ventricular myocytes

Abstract

Abstract: In neonatal rat ventricular myocytes tetrodotoxin (TTX), a specifie blocker of the Na current (INa) decreases the beating rate and the slope of the diastolic depolarization when these cells develop spontaneous activity in culture (Schanne et al., J.Mol.Cell.Cardiol., 9:269-283, 1977). The objective of this study was to measure and characterize the steady state component of INa, in neonatal rat ventricular myocytes to see whether this current component can modulate the diastolic depolarization. Cardiocytes from one day old rats were isolated by enzymatic digestion and studied 5-14 and 24-36 hours after explantation at room temperature with the patch clamp method in the whole-cell configuration. After pharmacological isolation of INa, its steady state and transient components were recorded using depolarizing pulse protocols with a patch amplifier whose current sensitivity had been increased to resolve the small steady state INa. In 27 of the total 43 cells an I-V relation of the steady state INa was found that contained 2 peaks at -49.0 ± 1.4mV (range -66 to -40mV, negative peak) and at -15.4 ± 1.0mV (range -39 to +9mV, positive peak) for the cells cultured < 14 hours. The mean amplitude of the maximum steady state was 4.0 ± 0.3pA. In the cells cultured > 24h, the potentials where the peaks occurred were shifted in the hyperpolarized direction to -54.6 ± 1.3mV and -21.4 ± 1.3mV respectively. There was no significant difference in the amplitude and range of the steady state INa, with time in culture. To test whether the 2 peaks represented 2 different INas, TTX was used. A high concentration (200/µM) abolished both peaks of the steady state current and the transient component of INa. A low concentration (10/µ ) inhibited the positive peak by 51.3 ± 7.8% in cells cultured < 14h whereas the negative peak did not change. In cells cultured > 24h the inhibition by 10/µM TTX increased to 91.5 ± 7.5% for the positive peak but the negative peak remained unchanged. The transient component of INa, was analyzed to obtain the elements for a quantitative description of the steady state INa . The I-V relation of the transient INa could be described as a single Na current. During time in culture (a) the potential of half maximal steady state inactivation changed from -66.4 to -74.8mV and the slope factor decreased from 7.8 to 6.4mV; (b) the potential of the half maximal normalized conductance shifted from -29.3 to -41.8mV with a change in slope factor from 7.8 to 5.1mV; and (c) the time in culture did not influence the current density of 107.0 ± 8.0/µA/cm2 and the maximum chord conductance of 2.5 ± 0.5mS/cm2. Moreover, the inactivation of Ina was a monoexponential process shortly after explantation while it took 2 time constants to describe the inactivation of the transient in cells cultured > 24h. We concluded that in neonatal rat ventricular cells (a) two steady state INa are present that can be distinguished by their TTX sensitivity and the potential where the peak steady state current occurs; (b) the steady state current with the more negative peak is associated with the experimentally determined transient INa; (c) the shape of the I-V curves of both steady state currents is compatible with the I-V curve of a window current; (d) if the background current with the more positive peak is a window current, the conductance of its transient component must be low and comparable to that of the steady state component; (e) the 2 steady state components of INa appear to reflect the properties of 2 isoforms of the Na channel molecule whose relative importance changes with time in culture and development so that at a later stage the more TTX sensitive isoform predominates. This could explain the increase in TTX sensitivity of the transient INa by a factor of 10 between the neonatal and adult rat; and (f) the 2 steady State INa s have considerable physiological importance because the current with the negative peak can modulate the diastolic depolarization whereas the current with the positive peak can influence the plateau phase of the action potential and consequently the action potential duration. || Résumé: Dans les myocytes ventriculaires de rats nouveau-nés, la tétrodotoxine (TTX), un bloqueur spécifique du courant sodique (INa), diminue la fréquence des battements et la pente de la dépolarisation diastolique quand ces cellules développent une activité spontannée après la mise en culture (Schanne et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 9:268-283, 1977). Le but de cette étude était de mesurer et de caractériser la composante basale du INa, chez les myocytes du ventricule du rat nouveau-né pour voir si cette composante du INa peut influencer la dépolarisation diastolique. Des cardiocytes dérivés de rats âgés de 1 jour furent isolés par digestion enzymatique et étudiés 5 à 14 et 24 à 36h après la mise en culture. Les expériences furent effectuées à la température de la pièce en employant la méthode de patch clamp en configuration cellule entière. Après isolation pharmacologique du INa sa composante basale et la composante transitoire furent mesurées en employant des pulses dépolarisantes avec un amplificateur de patch, spécialement modifié pour résoudre la petite composante basale du INa. Chez 27 cellules sur un total de 43, une relation I-V de la composante basale du INa, était trouvée, celle-ci montrait 2 pics à -49.0 ± 1.4mV (écart -66mV à -40mV, pic négatif) et à -15.4 ± 1.0mV (écart -39mV à +9mV, pic positif) dans des cellules cultivées pour moins de 14h. L'amplitude moyenne du maximum de la composante basale du INa fut 4.0 ± 0.3pA. Chez les cellules cultivées pour plus de 24h, les potentiels auxquels les pics apparaissaient furent déplacés vers des valeurs plus négatives, -54.6 ± 1.3mV et -21.4 ± 1.3mV respectivement. Cependant, l'amplitude du courant et l'écart de voltage où apparaissaient les pics n'étaient pas influencés par le temps de mise en culture. Afin de vérifier si les deux pics représentaient deux INas différents, la TTX était utilisée. Une concentration élevée de 200µM abolissait les deux pics du courant basale et la composante transitoire du Ina. Une concentration basse (10/µM) inhibait le pic positif de 51.3 ± 7.8% chez des cellules < 14h en culture et l'amplitude du pic négatif ne changeait pas de façon significative. Chez des cellules > 24h après la mise en culture, l'inhibition par 10/µM de TTX augmentait à 91.5 ± 7.5% pour le pic positif mais l'amplitude du pic négatif ne changeait pas. La composante transitoire du INa a été analysée pour obtenir les éléments pour décrire quantitativement la composante basale. La relation I-V de la composante transitoire du pouvait être décrite comme une seule composante transitoire du INa. Avec l'augmentation du temps de culture (a) le potentiel où 50% d'inactivation au régime établi était observé passait de -66.4 à -74.8mV et le facteur de pente diminuait de 7.8 à 6.4mV; (b) le potentiel où la conductance normalisée était de 50% fut déplacé de -29.3 à -41.8mV accompagné d'une diminution du facteur de pente de 7.8 à 5.1mV; et (c) le temps en culture n'influençait pas la densité du courant (107.0+8.0/µA/cm2) et la conductance maximale (maximum chord conductance) de 2.5±0.5mS/cm2. De plus, l'inactivation du INa fut monoexponentielle < 14h après la mise en culture mais 2 constantes de temps furent nécessaires pour décrire le décours de l’inactivation chez des cellules 24h après l'explantation. En conclusion, nous constatons que chez des cellules ventriculaires de rats nouveau-nés (a) existent deux différents courants basales sodiques qui se distinguent par leur sensitivité vis-à-vis la TTX et par les potentiels où apparaissent leurs pics; (b) le courant basale avec le pic négatif est associé avec le courant transitoire mesuré expérimentalement; (c) l'allure des deux courbes I-V des courants basales est compatible avec l'allure de la courbe I-V d'un courant de fenêtre; (d) si on admet que le courant basale avec le pic positif est un courant de fenêtre, la conductance de sa composante transitoire doit être basse et comparable à celle du courant basale; (e) les deux courants basales sodiques reflètent les propriétés des deux isoformes de la molécule du canal sodique dont le rapport change avec le temps après la mise en culture et le développement, de sorte que chez l'animal adulte l'isoforme à haute sensibilité vis-à-vis la TTX est prédominant. Ceci pourrait expliquer l'augmentation de la sensibilité du INa transitoire vis-à-vis de la TTX par un facteur de 10 chez le rat adulte par rapport au rat nouveau-né; et (f) les deux composantes des courants basales sont d'une importance phsyiologique considérable parce que le courant avec un pic négatif peut moduler la dépolarisation diastolique tandis que le courant avec le pic positif peut influencer la phase de plateau du potentiel d'action et en conséquence la durée du potentiel d'action.