Expression et caractérisation du canal potassique voltage-dépendant lymphocytaire Kv1.3 chez les cellules HEK 293

Abstract

Les canaux K[indice supérieur +] font partie d'une famille de protéines impliquées dans le passage sélectif des ions K[indice supérieur +] chez tous eucaryotes. Dans le cas du lymphocyte, l'activité de ces canaux est intimement associée au processus d'activation en réponse aux agents mitogéniques. Chez le lymphocyte T humain périphérique, seul le type n a été mis en évidence et il en est de même de la lignée lymphocytaire T Jurkat. Ce type de canal montre une sensibilité aux bloqueurs, tétraéthylammonium (TEA), 4-aminopyridine (4-AP) et la charybdotoxine. La structure du canal est composée de sous-unités [alpha] et [bêta] (4:4). Un profil d'hydropathie montre que la sous-unité [alpha] Kv1.3 possède 6 régions transmembranaires (S1 a S6) et les régions N- et C-terminales sont localisées du côté intracellulaire. Le pore H5 est situé entre les segments S5 et S6. Le segment S4 est responsable de la sensibilité au voltage, tandis que les segments S5 et S6 contribuent à la formation du pore. Le canal Kv1.3 est régulé par phosphorylation impliquant la PKA, la PKC et les PTK.Les sites probables de phosphorylation sont dans la région C-terminale (un site PKA), dans les régions cytosoliques (3 sites PKC) et en N-terminal (un site PTK). Des mutants du canal Kv1.3 (complet, [delta]459-523, [delta]S1S2, [delta]S1S4 et [delta]S2) ont été générés par la technique d'amplification PCR et les produits obtenus ont été clonés dans un vector d'expression eucaryote et transfectés chez la lignée de cellules HEK 293 afin d'étudier la relation structure-activité.Les études électrophysiologiques ont montré que seul le canal Kv1.3 complet et [delta]459-523 reconstituent des canaux K[indice supérieur +] et conservent sensiblement les mêmes propriétés que le canal natif du lymphocyte Jurkat. Des études d'immunolocalisation indirecte ont montré la présence de ces deux canaux à la surface membranaire des cellules HEK 293. Par contre, les mutants [delta]S1S2, [delta]S1S4 et [delta]S2 ne montrent pas d'expression à la surface membranaire et par le fait même, aucun courant autre que celui du au canal endogène ne peut être mesuré.Les effets de la PKA et par la PKC ont été étudiés sur les canaux Kv1.3 complet et [delta]459-523. Nos résultats ont montré que ces deux canaux sont affectés par la PKC puisque l'ajout de TPA (16 nM) diminue l'amplitude du courant d'environ 30%. Par contre, seule l'activité du canal Kv1.3 complet est inhibée à 30% par le 8Br-cAMP (1 mM). Ces résultats suggèrent que le canal Kv1.3 transfecté montre une sensibilité partielle aux effets de ces deux protéines kinases qui inhibent complément l'activité du canal Kv1.3 chez le lymphocyte Jurkat. La sous-unité Kv[bêta] accélère la cinétique d'inactivation des canaux K[indice supérieur +]. Puisque le canal Kv1.3 transfecté s'inactivait très lentement, des études d'inactivation ont été entreprises en présence des sous-unités Kv[bêta]1.2 et Kv[bêta]2. Nos résultats montrent que la sous-unité Kv[bêta]1.2 accélère l'inactivation du canal Kv1.3. Cependant, des études de régulation par la PKC et par la PKA ont montré que ces sous-unités Kv[bêta] ne sont pas impliquées dans la régulation du canal Kv1.3. Des études de RT-PCR et d'analyse de type Southern sur l'ADN génomique de cellules Jurkat n'ont pas permis de mettre en évidence une sous-unité Kv[bêta] propre aux lymphocytes Jurkat.