| dc.description.abstract | Afin d'isoler le récepteur AT[indice inférieur 2] et d'identifier ainsi quelques-unes de ses propriétés biochimiques, nous avons utilisé l'approche du marquage par photoaffinité. Pour ce faire, nous avons développé un analogue photosensible de l'angiotensine II (AngII) le Sar[indice supérieur 1], Val[inidce supérieur 5], p-benzoylPhe[indice supérieur 8]]AngII (AngII-Bpa[indice supérieur 8]). Cet analogue reconnaît le récepteur AT[indice inférieur 2] avec une forte affinité IC[indice inférieur 50] de 0.3 nM). À l'aide de l'analogue radioiodé [indice supérieur 125]I-AngII-Bpa[indice supérieur 8]), nous avons photomarqué avec un rendement élevé (70%) et spécifiquement le récepteur AT[indice inférieur 2] du myomètre humain. L'analyse des complexes covalents par électrophorèses sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) a révélé une bande radioactive correspondant à une protéine de masse moléculaire apparente (Mr) de 68 kDa. Par la même approche nous avons marqué le récepteur AT[indice inférieur 2] des lignées cellulaires PC-12 et Swiss 3T3. L'analyse de ces complexes covalents par SDS-PAGE a révélé des M[indice inférieur r] de 140 kDa et 90 kDa chez les cellules PC-12 et Swiss 3T3 respectivement. La déglycosylation du récepteur AT[indice inférieur 2] du myomètre humain et des cellules PC-12 et Swiss 3T3 a significativement diminué les M[indice inférieur r] jusqu'à une valeur de 31 kDa. De plus, des études de cinétiques de déglycosylation ont démontré une baisse graduelle de la M[indice inférieur r] en trois étapes, suggérant ainsi la présence d'au moins trois chaînes d'oligosaccharides sur le récepteur AT[indice inférieur 2]. En traitant les cellules PC-12 avec un bloqueur métabolique de la N-glycosylation, la tunicamycine, nous avons remarqué, suite au marquage des cellules, que ces dernières expriment à leur surface trois populations de récepteurs avec des M[indice inférieur r] de 63 kDa, 47 kDa et 31 kDa. Par des expériences de chromatographie d'affinité sur lectine, nous avons observé que les populations à 63 kDa et 47 kDa correspondent à des formes partiellement glycosylées et que la population à 31 kDa correspond à la forme déglycosylée du récepteur AT[indice inférieur 2] Des études de liaison effectuées sur les cellules PC-12 exprimant l'une ou l'autre de ces populations partiellement glycosylées ont révélé une baisse d'affinité d'un facteur deux pour l'AngII. Nous avons développé un autre analogue photosensible de l'AngII en modifiant la position 1 de la molécule par un résidu Bpa. Nous avons utilisé le [indice supérieur 125]I-AngII-Bpa[indice supérieur 1] et le [indice supérieur 125]I-AngII-Bpa[indice supérieur 8] afin de définir les domaines de liaison du récepteur AT[indice inférieur 2]. Suite à différentes digestions enzymatiques et chimiques des complexes covalents, nous avons déterminé la taille des fragments obtenus et avons retracé leurs positions dans le récepteur. Les résultats démontrent que les positions 1 et 8 des analogues photoactivables interagissent respectivement avec le segment amino-terminal (résidus 2 a 30) et le troisième domaine transmembranaire (résidus 129 a 138) du récepteur AT[indice inférieur 2]. Ces résultats montrent que le récepteur AT[indice inférieur 2] est une glycoprotéine possédant au moins trois chaînes d'oligosaccharides de types complexes. La variabilité de la M[indice inférieur r] du récepteur AT[indice inférieur 2], observée dans différents tissus, est due essentiellement à des degrés différents de N-glycosylation. La N-glycosylation du récepteur AT[indice inférieur 2] a peu d'influence sur ses propriétés de liaison et n'est pas essentielle à son transport vers la membrane plasmique. Il est aussi proposé que le domaine de liaison du récepteur AT[indice inférieur 2] est composé de résidus situés à la fois dans le segment amino-terminal extracellulaire et le troisième domaine transmembranaire. | fr |
