Étude de la relation structure/fonction du récepteur du "platelet-activating factor" humain par mutagenèse dirigée

Abstract

Le "platelet-activating factor" (PAF) est un puissant médiateur phospholipidique produisant un large éventail de réponses biologiques. Le récepteur du PAF (PAFR) fait partie de la superfamille des récepteurs couples aux protéines G (RCPGs). Ce récepteur lie le PAF avec haute affinité et est couplé à de multiples voies de signalisation menant à des réponses biologiques pouvant être inhibées par une variété d'antagonistes du PAF structurellement distincts.L'objectif principal de mes travaux de doctorat consistait à caractériser la relation structure/fonction du PAFR humain par voie de mutagenèse dirigée. Nous cherchions à déterminer des acides aminés du PAFR pouvant être impliqués dans le couplage à la protéine G et dont la mutation pourrait mener à des changements de structure de la protéine, conférant une activité constitutive au récepteur. Nous avons donc muté deux résidus adjacents, Ala230 et Leu231, de la partie C-terminale de la 3e boucle intracellulaire du PAFR en Glu et Arg, respectivement. La substitution de Leu231 par un Arg (mutant L231R) amena deux modifications majeures: (1) une activité constitutive accrue du PAFR en termes de production d'inositol phosphates (IPs) et (2) une plus grande affinité du récepteur pour le PAF (agoniste), mais non pour le WEB2086 (antagoniste). Le mutant L231R semble pouvoir atteindre au moins deux conformations distinctes: (i) un état de haute affinité plus élevé que le récepteur de type sauvage (WT) dépendant du couplage à la protéine G et (ii) un état découplé du récepteur d'affinité plus haute que l'état correspondant du récepteur WT. La substitution de l'Ala230 par un Glu résulta aussi en deux modifications majeures: (1) une perte d'activation du récepteur en termes de production d'IPs suite à une stimulation au PAF et (2) une baisse d'affinité marquée du récepteur pour le PAF et non pour le WEB2086. Des expériences de liaison utilisant du GTP[gamma]S ont démontré que le mutant A230E possède une basse affinité, inhérente à la molécule du récepteur. Nous avons également utilisé la mutagenèse dirigée afin d'étudier le rôle du résidu Asp63 situé dans le 2e domaine transmembranaire (DTM), des acides aminés Phe97 et Phe98 du 3e DTM, ainsi que des résidus Asn285 et Asp289 du 7e DTM, dans la liaison des ligands, dans l'activation et la régulation de la conformation du PAFR. La substitution de l'Asp63 par un Asn résulta en l'abolition du couplage à la protéine G et de la production d'IPs suite à une stimulation au PAF, et augmenta l'affinité du récepteur pour l'agoniste. D'autre part, les résultats obtenus de la mutation de l'Asp289 en Ala et en Asn indiquent que le résidu 289 n'est pas requis pour la liaison du PAF, mais que la formation de ponts hydrogénés impliquant ce résidu pourrait être essentielle à l'activation du récepteur. Lorsque l'Asn285 fut mutée en Ala, le récepteur résultant montrait des caractéristiques identiques au récepteur WT. Nos résultats suggèrent que les résidus 63, 97, 98, 230, 231, 285 et 289, ainsi que la partie C-terminale de la 3e boucle intracellulaire influencent la conformation et la transition d'état inactif à actif du PAFR.