Sélection de promoteurs ARN reconnus par l'ARN polymérase de Escherichia coli

Abstract

Les viroïdes sont de petits ARN circulaires simple brin qui infectent les plantes supérieures, causant ainsi d'importantes pertes économiques dans les domaines agro-alimentaire et horticole. Ces ARN ne sont pas encapsidés, ne possèdent pas de région codante et se répliquent de façon presque autonome par un mécanisme en cercle roulant. La seule étape du cycle de vie des viroïdes qui requiert la machinerie de l'hôte est la polymérisation de l'ARN. Par ailleurs, cette étape est certainement la moins bien connue, particulièrement chez le viroïde de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd). Le but de ce travail est de découvrir des séquences importantes pour l'initiation de la réplication d'une molécule modèle d'ARN inspirée du PLMVd. Un protocole de sélection de promoteur en ARN a d'abord été mis au point. Dans ce type de protocole, des étapes pertinemment désignées s'enchaînent sous forme de cycles afin de sélectionner une molécule d'intérêt. Toutes les étapes constituant le complexe protocole ont été testées avec un témoin positif, basé sur une région minimale du PLMVd connue pour initier la réplication in vitro. Cette molécule a servi à la vérification et à l'optimisation individuelles des nombreuses étapes. Ce protocole amélioré a ensuite été utilisé pour sélectionner des molécules reconnues par l'ARNP d' E. coli à partir d'une population aléatoire d'ARN. Cette sélection a permis l'isolement de plusieurs variants qui ont rapidement montré des ressemblances en terme de séquence primaire au cours des cycles de sélection. En effet, sur trente positions aléatoires, une boite de six nucléotides (CAGACG) se retrouvant à divers endroits est apparue au quatrième cycle puis a été retrouvée presque intégralement dans toutes les séquences à partir du cinquième cycle. Une investigation sur cette boîte a mis en évidence une analogie avec une séquence retrouvée près du site d'initiation in vivo du PLMVd ainsi qu'avec des produits de sélection pour un promoteur ADN simple brin. Ceci semble pointer vers des éléments impliqués dans la réplication dépendante de l'ARN polymérase d'E. coli . L'effet de la boîte conservée CAGACG sur la réplication a été étudié. Le patron de réplication de molécules dont la boite a été modifiée (délétion ou modification) est distinct de celui de la molécule originale. Aussi, l'analyse de la séquence des petits ARN (pARN) produits lors de la réplication révèle l'implication des 6 nt pour fixer l'initiation de la polymérisation. En conclusion, ces résultats s'ajoutent aux évidences qui mèneront vers la découverte des séquences nécessaires à la réplication d'une molécule modèle d'ARN, autant in vitro (reconstitution d'un monde ARN) que in vivo (dans les viroïdes).