La protéine G hétérotrimérique G[indice inférieur q] interagit avec diverses GEFs d'ARF6 et l'activité GEF est impliquée dans l'endocytose du GPCR TP[bêta]

Abstract

La famille des récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) est la plus grande famille de récepteurs membranaires et est très importante au niveau de la pharmacologie, de la physiologie et des industries pharmaceutiques. En effet, les GPCRs composent 1 à 2% du génome des mammifères et environ 60% des médicaments sur le marché ciblent des GPCRs. Dans notre laboratoire, nos études portent principalement sur les récepteurs du thromboxane A[indice inférieur 2] (TP). On dénombre deux isoformes de TP, soit TP[alpha] et TP[bêta]. Nous avons déjà démontré que seule TP[bêta] est capable d'internalisation induite par agoniste et constitutive. Le récepteur TP[bêta] signale principalemement via la protéine G hétérotrimérique G[indice inférieur q]. Dernièrement, nous avons observé qu'ARNO, une GEF d'ARF6, interagit avec la protéine G[indice inférieur q] et est impliquée dans l'endocytose de TP[bêta]. Dans cette présente étude, nous démontrons que plusieurs GEFs d'ARF6 interagissent avec G[indice inférieur q]. Les GEFs sont responsables de l'échange du GDP en GTP et permettent l'activation de leurs protéines cibles. Ainsi, nous démontrons que les GEFs GRP1, ARF-GEP[indice inférieur 100], cytohesine-1 et EFA6 co-immunoprecipitent avec G[indice inférieur q]. Dans le cas de GRP1 et cytohesine-1, l'état d'activation de la sous-unité [alpha] de G[indice inférieur q] est important. En effet, GRP1 se lie à G[indice inférieur q] uniquement lorsqu'elle est sous sa forme active, c'est-à-dire liée au GTP. Pour ce qui est de cytohesine-1, cette GEF se lie au forme active et inactive de G[indice inférieur q], mais plus fortement à la forme active. D'un autre côté, ARF-GEP[indice inférieur 100] et EFA6 se lient autant à G[indice inférieur q]-GDP qu'à G[indice inférieur q]-GTP. Par la suite, nous nous sommes concentrés sur l'interaction cytohesine-1 - G[indice inférieur q]. Nous avons démontré que cytohesine-1 lie directement G[indice inférieur [alpha]q] et que la portion N-terminale de cytohesine-1 (domaines CC et Sec7) est responsable de cette interaction. Par la suite, nous avons étudié l'effet de cytohesine-1 sur l'internalisation de TP[bêta]. Dans cette portion de l'étude, nous utilisons le mutant cytohesine-1(E157K) qui est un mutant de cytohesine-1 qui ne possède plus d'activité GEF. Nous démontrons que cytohesine-1 et cytohesine-1(E157K) augmente et diminue respectivement l'expression de surface de TP[bêta] dans les cellules HEK293. De plus, la surexpression du mutant cytohesine-1(E157K) a un effet négatif sur l'internalisation de TP[bêta]. Les cellules surexprimant cytohesine-1(E157K) ont 50% moins d'endocytose de TP[bêta] après 60 minutes de stimulation avec le mimétique du TXA[indice inférieur 2], le U46619. Aussi, l'immunofluorescence a permis de visualiser que le mutant cytohesine-1(E157K) a un effet drastique sur la morphologie des cellules HEK293. En bref, nos résultats démontrent pour la première fois que plusieurs GEFs d'ARF6 interagissent avec G[indice inférieur q]. Aussi, cytohesine-1 se lie directement à G[indice inférieur [alpha]q] via sa portion N-terminale et son activité GEF semble impliquée au niveau de la réorganisation du cytosquelette et de l'endocytose de TP[bêta].