Le clonage et l'expression du cytochrome P450c17 humain dans le but d'étudier le rôle de la phosphorylation dans son activation

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Publication date
2003Author(s)
Picard, Mireille
Abstract
Le but de ce projet est d'étudier la phosphorylation sur le P450c17 humain. Un clone a donc été construit à partir de l'ARN extrait de glandes surrénales foetales et de cellules H295R. Une RT-PCR a été réalisée afin d'amplifier la séquence codante du P450c17, soit 1725 pb. Une fois l'ADNc humain cloné, séquencé et corrigé, son expression a été étudiée dans les cellules COS-1 (ces cellules ont été choisies car elles n'expriment pas le P450c17) à l'aide du vecteur pcDNA3.1/V5-His[indice supérieur Copyright]TOPO[indice supérieur Marque déposée]. Des tests d'optimisation de la transfection ont montré qu'une incubation de 24 heures avec comme réactif le fuGENE 6 (6 [micro]l) et 2 [micro]g d'ADN, était la meilleure condition pour obtenir le taux le plus élevé de transfection. Afin de savoir si le clone possédait l'activité 17[alpha]-hydroxylase et l'activité 17,20-lyase, des incubations avec divers substrats stéroïdiens et avec ou sans stimulation au 8-bromoadenosine 3 ' :5 ' -cyclic monophosphate furent réalisées. Une stimulation au 8-bromo permet d'apporter une phosphorylation de certains acides aminés qui sont nécessaires pour déclencher l'activité 17,20-lyase."--Résumé abrégé par UMI.