Le clonage et l'expression du cytochrome P450c17 humain dans le but d'étudier le rôle de la phosphorylation dans son activation

Abstract

Le but de ce projet est d'étudier la phosphorylation sur le P450c17 humain. Un clone a donc été construit à partir de l'ARN extrait de glandes surrénales foetales et de cellules H295R. Une RT-PCR a été réalisée afin d'amplifier la séquence codante du P450c17, soit 1725 pb. Une fois l'ADNc humain cloné, séquencé et corrigé, son expression a été étudiée dans les cellules COS-1 (ces cellules ont été choisies car elles n'expriment pas le P450c17) à l'aide du vecteur pcDNA3.1/V5-His[indice supérieur Copyright]TOPO[indice supérieur Marque déposée]. Des tests d'optimisation de la transfection ont montré qu'une incubation de 24 heures avec comme réactif le fuGENE 6 (6 [micro]l) et 2 [micro]g d'ADN, était la meilleure condition pour obtenir le taux le plus élevé de transfection. Afin de savoir si le clone possédait l'activité 17[alpha]-hydroxylase et l'activité 17,20-lyase, des incubations avec divers substrats stéroïdiens et avec ou sans stimulation au 8-bromoadenosine 3 ' :5 ' -cyclic monophosphate furent réalisées. Une stimulation au 8-bromo permet d'apporter une phosphorylation de certains acides aminés qui sont nécessaires pour déclencher l'activité 17,20-lyase."--Résumé abrégé par UMI.