Purification et caractérisation d'une nouvelle activité tyrosine phosphatase présente dans la membrane du grain de zymogène de pancréas de porc

Abstract

Le présent travail porte sur la purification et la caractérisation d'une activité tyrosine phosphatase présente dans la membrane du grain de zymogène de pancréas de porc. Lors d'études entreprises dans notre laboratoire pour évaluer la régulation des activités tyrosine kinases et phosphatases dans le pancréas de rat stimulé par la caeruléine et la somatostatine (SS), il a été démontré que l'activité tyrosine phosphatase des membranes du grain de zymogène (mgzs) était régulée de façon positive par la caeruléine et négative par la SS. Le but de notre travail fut donc de purifier et de caractériser l'enzyme responsable de cette activité tyrosine phosphatase afin de l'identifier. Des membranes de grains de zymogène de pancréas de porc ont été purifiées puis traitées à la PIPLC pour éliminer la GP2. Le culot a subit une solubilisation à l'octylglucoside 2%. Le surnageant fut chromatographié à l'aide dune colonne DEAE-5PW sur HPLC. Cette étape a résulté en un enrichissement de 15 fois avec un rendement de 20%. L'enzyme semi-purifiée a son pH optimum à 5.0, elle est inhibée par l'orthovanadate (1 mM), un inhibiteur des tyrosine phosphatases (PTPases), par le zinc (1 mM), par le fluorure de sodium (1 mM) et par le tartrate de sodium (10 MM). Son activité n'est pas effectée par le calcium ni par le magnésium. Sa purification partielle sur gel non dénaturant et sa réaction avec un anticorps dirigé contre le domaine catalytique des PTPases ont révélé une seule bande avec un PM estimé à 50 kDa. Cette enzyme n'est pas N-glycosylée, n'est pas affectée par les protéases trypsine, cathepsines B, C, D, mais elle est affectée par la protéase chymotrypsine. De plus, pour être active, l'enzyme n'a pas besoin d'être phosphotyrosilée. Comme une activité PTPase est présente dans la mgz de rat et qu'elle est activable par la caeruléine et inhibable par la somatostatine, nous croyons que cette activité PTPase pourrait être cette protéine de 50 kDa.