Construction et caractérisation de mutants immunoréactifs du récepteur AT[indice inférieur 1] de l'angiotensine II

Abstract

Les analyses structurales des récepteurs couplés aux protéines G ont été grandement limitées au photomarquage et à la mutagenèse dirigée. Ceci est principalement dû à la difficulté de produire des anticorps contre cette classe de récepteurs. Pour contrer cette difficulté, nous avons construit des mutants du récepteur de l'angiotensine II (AT[indice inférieur 1]) contenant l'épitope FLAG (octapeptide synthétique) dans la portion N-terminale extracellulaire (hAT[indice inférieur 1]-FLAG N) ou la portion C-terminale cytoplasmique (hAT[indice inférieur 1]-FLAG C). Nous avons aussi utilisé un mutant mAT[indice inférieur 1a]-FLAG NP, fourni par le Dr Brian Kobilka. Les mutants furent produits par mutagenèse dirigée et sous-clonés dans un vecteur d'expression eucaryote. Par la suite, les récepteurs-FLAG furent exprimés dans les cellules COS-7, ce qui nous a permis d'étudier leur activité fonctionnelle ainsi que leur immunoréactivite par les approches d'immunoprécipitation, de cytométrie de flux, d'immunofluorescence et d'immunobuvardage. Les mutants AT[indice inférieur 1]-FLAG, particulièrement le récepteur mAT[indice inférieur 1a]-FLAG NP, représentent des outils intéressants pour l'étude du récepteur AT[indice inférieur 1] de l'angiotensine II. --Résumé abrégé par UMI.