Déterminants moléculaires de la spécificité du transfert conjugatif du plasmide TP114 dans le microbiote

Abstract

La biologie synthétique est une combinaison de la biologie et de différentes branches de l’ingénierie offrant une plus grande capacité de compréhension et de manipulation des systèmes biologiques pour la création de nouvelles propriétés. Le développement de microorganismes vivants capables d’effectuer des tâches de hautes précisions, robustes et prédictibles semble très prometteur pour diverses applications en biotechnologie, en médecine, en agriculture et en environnement. Ces approches sont d’un grand intérêt dans le domaine biomédical où les bactéries sont déjà employées comme vaccins vivants et pourraient éventuellement servir au traitement des maladies infectieuses causées par des pathogènes multirésistants, des maladies métaboliques et immunes, des dysbioses et même des cancers. L’avancement dans la conception de nouvelles thérapies représente un défi unique et une occasion pour l’application pratique des outils de biologie synthétique. Tous les microorganismes évoluent en interagissant avec leur environnement. Le contact avec des surfaces ou autres cellules bactériennes, eucaryotes ou particules virales, mène à des changements physiologiques en réponse à ces stimuli. Ces interactions microbiennes sont essentielles pour la croissance et la survie dans des niches spécifiques et sont souvent accomplies par des appendices extracellulaires comme des flagelles, des pili ou des récepteurs protéiques. Puisque la nature a déjà mis au point des mécanismes de reconnaissance spécifique, pourquoi ne pas les étudier en profondeur pour nous permettre de les modifier selon nos besoins? C’est dans cette lignée que mon présent projet doctoral s’inscrit puisque les avancées dans le domaine biomédical ne pourraient être accomplies sans la compréhension des concepts fondamentaux sous-jacents. La nouvelle technologie COnjugative Probiotic (COP) a été développée pour remplacer les antibiotiques dans le traitement d’infection entériques. Ce système exploite la conjugaison bactérienne, mécanisme par lequel les bactéries s’échangent du matériel génétique et acquièrent souvent des gènes de résistance. Ainsi, par l’intermédiaire du plasmide conjugatif TP114, un module CRISPR-cas9 est livré dans les bactéries et permet d’éliminer avec précision les cellules problématiques en ciblant un ou des gènes spécifiques. TP114 a été sélectionné après le criblage d’une douzaine de plasmides de familles différentes puisqu’il s’est révélé être l’élément conjugatif le plus efficace dans le tractus gastro-intestinal de souris. L’étude du transfert conjugatif de TP114 dans différentes conditions expérimentales a révélé qu’un pilus accessoire était responsable de la stabilisation de la paire de conjugaison. Ce type de pilus s’avère crucial pour le transfert efficace dans des environnements instables, comme en bouillon/in vivo, où la mobilité bactérienne, les forces des fluides et autres facteurs environnementaux peuvent perturber l’interaction entre deux bactéries. Une compréhension plus approfondie de ce pilus bactérien pourrait éventuellement permettre de l’utiliser en tant que circuit génétique biosenseur qui pourrait être modulé pour répondre à un stimulus environnemental précis. Dans un premier temps, mon projet doctoral a consisté à caractériser le pilus accessoire de TP114, un plasmide conjugatif de la famille IncI2 retrouvé chez les entérobactéries. Ce pilus est constitué de pilines majeures PilS et de pilines mineures PilV qui sont toutes deux essentielles pour initier le contact entre les cellules donneuses et réceptrices et permettre le transfert conjugatif de TP114 dans les environnements instables, mais ne sont pas nécessaires en milieu solide. L’analyse phylogénétique et l’examen des caractéristiques de la piline majeure PilS, constituant principal du pilus ont permis de classifier ce pilus dans la famille b des pili de type IV (T4Pb). La présence du pilus a été observée en microscopie à fluorescence à l’aide d’un fluorophore conjugué à du maleimide. Le contexte génétique du T4Pb a aussi été étudié puisque le gène encodant la piline mineure (pilV) fait partie d’un shufflon. Ce système d’ADN à inversion multiple est constitué de plusieurs segments d’ADN flanqués de sites de recombinaison qui sont reconnus par une recombinase à tyrosine spécifique au shufflon (shufflase). Cette shufflase est responsable de l’inversion des différents segments d’ADN, ce qui a pour effet de changer la séquence codante de pilV et ainsi permettre la synthèse de différents variants de PilV. Le shufflon a été caractérisé et son importance pour la transmission du plasmide à différentes souches d’Escherichia coli a été investiguée. Huit variants différents de PilV ont été identifiés chez TP114, dont un nouveau variant jamais décrit jusqu’à présent. L’effet de la délétion soit de la piline majeure (pilS) ou de la piline mineure (pilV) lors de la conjugaison dans différentes conditions a été analysé. Ces résultats suggèrent que le T4Pb joue un rôle majeur dans la stabilisation de la paire de conjugaison in vitro, en bouillon, et in vivo, dans le tractus gastro-intestinal de la souris. Quant au shufflon, celui-ci agit comme un interrupteur biologique modifiant le spectre d’hôtes conjugatifs et permettant l’adaptation rapide et réversible à des contextes environnementaux différents. Dans un deuxième temps, le spectre d’hôtes entérobactériens de chacun des variants de PilV de TP114 a été exploré. Chez d’autres plasmides conjugatifs, il a été montré que la piline mineure reconnait des structures spécifiques du lipopolysaccharide (LPS) à la surface des cellules réceptrices. Ainsi, des milliers de transferts conjugatifs ont été effectués (i) avec des souches prototypiques pour les 5 types de core-LPS retrouvés chez E. coli et (ii) avec des mutants sélectionnés de la collection Keio, ayant chacun une délétion pour un gène impliqué dans la synthèse du LPS. L’analyse de ces données a permis d’associer des variants de PilV avec de nouvelles cibles du LPS encore inconnues jusqu’à aujourd’hui. En somme, les résultats présentés dans cette thèse ont permis d’approfondir nos connaissances sur le T4Pb du plasmide conjugatif TP114. Certaines connaissances pourront être appliquées aux futures applications biotechnologiques pour le traitement d’infections causées par des bactéries multirésistantes et peut-être même pour soigner d’autres maladies. L’extrémité du T4Pb pourrait être évoluée pour reconnaitre d’autres cibles ou modifiée pour y insérer une molécule de reconnaissance et détecter ou se lier à une panoplie de molécules cibles. L’ingénierie des mécanismes permettant la reconnaissance de cibles extracellulaires spécifiques et la médiation des comportements en aval constitue un défi important pour la biologie synthétique qui pourrait avoir un impact majeur dans le domaine biomédical.