The interrelationship between the endosomal sorting regulators RAB21, Retromer and WASH complex

Abstract

Abstract : The internalisation of different cell surface receptors, their ligands, macromolecules, and pathogens from the extracellular space is mediated by a highly regulated process called endocytosis. The fate of internalised cargoes is either to be trafficked to different subcellular locations (such as the trans-Golgi network or recycled back to the plasma membrane) or the cargo is directed to be degraded in the lysosome. Issues in endocytosis have been implicated in the development of neurodegenerative diseases, and cardiovascular and inflammatory diseases (several types of cancer). The cargo sorting occurs in the endosomal network. The early endosome is the first step in the sorting process. The early endosome recruits several sorting complexes namely retromer, commander and WASH complex to facilitate the proper trafficking of cargo. The sorting complexes such as WASH and retromer complex are known to interact with each other and influence each other’s endosomal localisation. The sorting complexes are also known to interact with other membrane organisers such as Rab GTPases like RAB21. RAB21 is previously shown to influence the cargo sorting process of specific cargoes based on recent work from Pr Jean laboratory. The primary purpose of this project is to understand the interrelationship between the different endosomal sorting regulators such as retromer, WASH complex and RAB21 in the cargo sorting process. The KOs of specific sorting regulator proteins such as FAM21(WASH) or VPS29(Retromer) along with RAB21 depletions were used in combination with immunofluorescence to assess the loss of sorting regulators. An investigation into the influence of RAB21 activation on WASH-mediated endosomal F-actin polymerisation crucial for cargo sorting was also performed. My work showed that the VPS29-depleted cells show a complete loss of endosomal FAM21. The observations of VPS29-depleted cells showed similar results obtained from the KOs of FAM21 and FAM21+RAB21. We used RAB21-depleted cells and rescued them with wildtype RAB21 (eGFP:RAB21-WT). These experiments suggested an increase in endosomal F-actin levels. My studies furthered the understanding of the intricate relationship between the different endosomal sorting regulators and could provide additional lines of investigation to understand the endosomal sorting of specific cargoes.

L'internalisation de différents récepteurs de surface cellulaire, de leurs ligands, macromolécules et agents pathogènes de l'espace extracellulaire est médiée par un processus hautement régulé appelé endocytose. Le sort des cargos internalisés est soit d'être acheminés vers différents emplacements subcellulaires (tels que le réseau trans-Golgien ou recyclé vers la membrane plasmique) ou d’être dirigé pour être dégradé dans le lysosome. Les problèmes d'endocytose ont été impliqués dans le développement de maladies neurodégénératives, de maladies cardiovasculaires et de maladies inflammatoires (plusieurs types de cancer). Le tri des cargos se produit dans le réseau endosomal. L'endosome précoce est la première étape du processus de tri. L'endosome précoce recrute plusieurs complexes de tri à savoir le retromer, le Commander et le complexe WASH pour faciliter le bon trafic des cargos. Les complexes de tri tels que WASH et le complexe retromer sont connus pour interagir les uns avec les autres et influencer la localisation endosomale de l'autre par le tri des cargaisons. Les complexes de tri sont également connus pour interagir avec d'autres organisateurs membranaires tels que les Rab GTPases comme RAB21. Il a été démontré récemment dans le laboratoire du Pr Jean, que RAB21 influence le processus de tri de divers cargos. L'objectif principal de ce projet est de comprendre l’interrelation entre les différents régulateurs de tri endosomal tels que retromer, le complexe WASH et RAB21 dans le processus de tri des cargos. Les KO de protéines régulatrices de tri telles que FAM21 (WASH) ou VPS29 (Retromer) ainsi que les déplétions de RAB21 ont été utilisées en combinaison avec l'immunofluorescence pour évaluer la perte de régulateurs de tri. Des expérimentations sur l'influence de l'activation de RAB21 sur la polymérisation endosomale de la F-actine médiée par WASH, cruciale pour le tri des cargaisons, ont également été effectuées. Mes travaux ont montré que les cellules appauvries en VPS29 montrent une perte complète de FAM21 aux endosomes. Les observations de cellules appauvries en VPS29 ont montré des résultats similaires obtenus à partir des KO de FAM21 et FAM21 + RAB21. Nous avons utilisé des cellules appauvries en RAB21, puis les avons sauvées par la réexpression de RAB21 de type sauvage (eGFP:RAB21-WT). Ces expériences suggèrent des niveaux de F-actine endosomale plus élevés dans ces conditions. Mes travaux ont permis de mieux comprendre la relation complexe entre les différents régulateurs de tri endosomal et pourraient fournir d'autres pistes d'investigation pour comprendre le tri endosomal de cargos spécifiques.