Validation et optimisation d’une méthode de séquençage des cassures bicaténaires chez le spermatide murin

Abstract

Les mutations de novo (MDN) sont transmises à la descendance quatre fois plus fréquemment par le père que par la mère et sont impliquées dans l’étiologie de plusieurs maladies neurodéveloppementales. Ce biais paternel dans la transmission de MDN est généralement associé au grand nombre de cycles de divisions cellulaires se produisant lors de la spermatogénèse comparativement à l’ovogénèse. Cependant, nos études ont démontré l’existence d’une vague de fragmentation de l’ADN lors de la spermiogénèse, étape haploïde de la spermatogénèse, évènement qui pourrait être en partie à l’origine de ce biais. En effet, la réparation des cassures double-brins de l’ADN (DSB) se fera dans ce contexte haploïde par des mécanismes sujets à l’erreur et les sites de DSB seront alors plus susceptibles aux MDN. Une cartographie préliminaire des sites préférentiels de DSB (points chauds de cassure ou hotspots) lors de la spermiogénèse a été réalisée et a révélé qu’en considérant seulement les gènes, ces sites seraient plus fréquemment retrouvés au niveau des gènes neurodéveloppementaux. Dès lors, la formation de DSB post-méiotiques serait la source principale de MDN et leur augmentation chez les spermatides favoriserait statistiquement la transmission de MDN à ces gènes augmentant le risque de désordres cognitifs chez la descendance. L’objectif de ce projet est de produire une cartographie des hotspots de DSB post-méiotiques chez la souris qui soit plus robuste et représentative de toutes les étapes de la spermiogénèse. Pour ce faire, une méthode de tri cellulaire, de capture des DSB ainsi que de préparation des librairies d’ADN ont été validées et optimisées afin de répondre à plusieurs limitations du précédent séquençage incluant un manque d’ADN de départ. La nouvelle cartographie a révélé que les hotspots sont retrouvés principalement au niveau de l’étape des spermatides condensés, et ce, principalement en région intergénique. En considérant le sous-ensemble des gènes, ceux-ci ont été retrouvés plus fréquemment en région promotrice. À la suite de l’analyse des termes ontologiques, il a été révélé que les gènes impliqués dans des processus neurodéveloppementaux ainsi que dans l’adhésion cellulaire était préférentiellement touchés. Dès lors, la vague de DSB observée lors de la spermiogénèse semble se produire préférentiellement à certains loci qui seront plus susceptibles à l’instabilité génétique. La cartographie améliorée pourra alors être utilisée afin d’étudier cette dernière, puis, en contexte clinique, pourra permettre d’évaluer le risque de transmission de MDN à la descendance en médecine personnalisée.

Abstract : De novo mutations are a type of mutation known to be transmitted four times more frequently by fathers than mothers. This type of mutation has been linked to the etiology of many neurodevelopmental disorders. The paternal bias observed in the transmission of de novo mutations is generally associated with the increased number of mitotic divisions during spermatogenesis compared to oogenesis. However, our studies have shown that a transient wave of double-strand breaks (DSBs) occur during spermiogenesis, the haploid step of spermatogenesis. These DNA double-strand breaks will then have to be repaired. However, in the haploid context of spermiogenesis, this process will be susceptible to the formation of de novo mutations as only error-prone repair mechanisms are available. A preliminary mapping of preferential sites (hotspots) of DSBs formation in different steps of spermiogenesis was generated. When considering genes only, hotspots were more frequently found in neurodevelopmental genes. Thus, transient post meiotic DSBs would be the principal source of de novo mutations and a rise in post meiotic DSBs would statistically promote the transmission of de novo mutations in neurodevelopmental genes increasing the risk of cognitive disorders. Therefore, considering the importance post meiotic DNA DSBs occurring in the male gamete could have in the etiology of cognitive disorders, it was necessary to generate a more robust and representative post meiotic DSB mapping in mice. The cell sorting, DSB capture, and DNA library preparation methods were validated and optimized to overcome the principal limitations of the previous mapping especially the limited amount of input DNA. The improved post meiotic DSB mapping revealed that a greater number of hotspots were found in condensed spermatids with a majority occurring in intergenic regions. When considering only genes, hotspots were found more frequently in promotors and in genes involved in neurodevelopmental and cell adhesion processes. This post meiotic DSB mapping could be used to study genetic instability at sites of hotspots and could eventually be used in the clinical context of precision medicine to study the risk of de novo mutations transmission to offspring.