Hippo pathway effector YAP1 is a regulator of intestinal epithelial cell differentiation

Abstract

Les cellules souches primordiales, qui sont situées à la base de la crypte dans l'intestin des mammifères, fournissent toutes les cellules épithéliales situées dans les cryptes et les villosités, comme les cellules absorbantes, les cellules caliciformes, les cellules de Paneth et les cellules entéroendocrines. La survie des cellules souches est associée à la niche qui est composée de divers signaux et facteurs provenant des cellules épithéliales et du mésenchyme environnant. Un signal important dont le rôle dans le maintien et la prolifération des cellules souches a été démontré est la voie de signalisation Hippo. Les signaux en amont, la cascade kinases et les gènes cibles en aval composent les trois parties de la voie de signalisation d'Hippo. Cette voie limite la croissance des cellules et la taille des organes par la régulation de YAP1 et TAZ qui sont les composants du coeur de la kinase. La voie active d'Hippo contribue à la phosphorylation et à l'inactivation des YAP1/TAZ, ce qui conduit à leur dégradation ou leur séquestration cytoplasmique. En l'absence de la voie Hippo, YAP1/TAZ actifs passent dans le noyau et induisent la transcription des gènes impliqués dans la croissance cellulaire. La présente étude vise à évaluer l'effet de YAP1 sur la différenciation des cellules épithéliales intestinales. Ainsi, l'expression de YAP1 a été neutralisée dans la cellule HT29 à l'aide de l'ARN interférant. Ensuite, l'immunoblot, l'immunofluorescence indirecte et l'analyse RT-qPCR ont été utilisées pour caractériser les cellules absorbantes et sécrétoires. Les résultats ont montré que l'expression des marqueurs de cellules absorbantes SI et DPPIV et des marqueurs de cellules caliciformes MUC2 et TFF3 a été augmentée de manière significative au niveau transcriptionnel et protéique par l'ablation de YAP1. La formation des cellules de type absorbante et de type caliciforme a été confirmée par immunofluorescence indirecte et microscopie électronique à transmission. De plus, l'expression de deux marqueurs de cellules souches, LGR5 et PROM1, a été réduite de manière significative dans la cellule HT29 déplétée en YAP1 par rapport au contrôle. Ensuite, le mécanisme par lequel YAP1 contrôle la différenciation de la cellule épithéliale intestinale a été étudié. Dans ce contexte, l'expression des facteurs de transcription CDX2, ATOH1, HES1, KLF4 et HNF1α a été mesurée à l'aide du qPCR. Les résultats ont montré une augmentation de CDX2 et ATOH1 ainsi qu'une légère augmentation du facteur de transcription HES1 dans la cellule HT29 déplétées en YAP1. L'augmentation de l'expression de la protéine CDX2 a été confirmée par immunobuvardage, tandis qu'ATOH1 n'était pas détectable. L'effet de CDX2 sur la différenciation des cellules absorbantes et caliciformes a été confirmé par l'ablation de CDX2 dans les cellules déficientes en YAP1. L'ablation de CDX2 dans ces cellules s'est accompagnée du retour à des niveaux de base d'expression de SI, MUC2 et TFF3 de même que de LGR5 et PROM1 comparables aux cellules contrôles. Cependant, l'expression de DPPIV est demeurée élevée suggérant l'implication d'autres facteurs. L'expression de MUC2 est également contrôlée par le facteur de transcription ATOH1. L'induction de l'expression d'ATOH1 dans la cellule HT29 a conduit à une augmentation de l'expression de MUC2. De plus, nos études d’inhibition des membres de la famille de kinase Src montrent une réduction de l’expression de YAP1 qui résulte à une augmentation de l’expression des marqueurs des cellules absorbante et à mucus et de CDX2. Nous pouvons donc conclure que YAP1 régule négativement la différenciation des cellules absorbantes et des cellules caliciformes par l'inhibition du facteur de transcription CDX2.

Abstract : LGR5+ crypt base columnar (CBC) stem cells that are located at the base of the crypt in the mammalian intestine, provide all the epithelial cells located in the crypts and villi including absorptive, goblet, Paneth and enteroendocrine cells. The maintenance of LGR5+ stem cells is associated with the niche that is composed of various signals and factors originating from the epithelial cells and surrounding mesenchyme. One important signal which has been reported to have a role in stem cell maintenance and proliferation is the Hippo signaling pathway. Upstream signals, a kinase core and downstream target genes compose the three parts of the Hippo pathway. This pathway restricts cell growth and organ size through regulation of YAP1 and TAZ, which are kinase core components. An active Hippo pathway contributes to the phosphorylation and inactivation of the YAP1/TAZ which leads to its degradation or cytoplasmic sequestration. In the absence of the Hippo pathway, active YAP1/TAZ passes into the nucleus and induces the transcription of genes involved in cell growth. The present study is aimed at the investigation of the effect of YAP1 on intestinal epithelial cell differentiation. Thus, YAP1 expression was knocked down in HT29 cells using shRNA. Then Western blot, immunofluorescence and RT-qPCR analysis were used for the characterization of absorptive and secretory cells. The results showed that the expression of the absorptive cell markers SI and DPPIV, and goblet cell markers MUC2 and TFF3 was increased significantly at both transcriptional and protein levels by YAP1 ablation. The formation of absorptive-like and goblet-like cells was confirmed using indirect immunofluorescence and transmission electron microscopy. Furthermore, the expression of the two stem cell markers LGR5 and PROM1 was decreased significantly in YAP1 knockdown HT29 cells compared with the control. Then the mechanism by which YAP1 controls the differentiation of the intestinal epithelial cell was studied. In this context, the expression of the CDX2, ATOH1, HES1, KLF4 and HNF1α transcription factors was measured using qPCR. The results showed an augmentation of CDX2 and ATOH1, and also a slight increase of the HES1 transcription factor in YAP1 knockdown HT29 cells. An increased expression of CDX2 protein was confirmed by Western blot analysis while ATOH1 expression was not at a detectable level. The effect of CDX2 on absorptive and goblet cell differentiation was confirmed by CDX2 ablation in shYAP1-expressing HT29 cells. CDX2 ablation in shYAP1-expressing HT29 cells was accompanied by a return of SI, MUC2 and TFF3 as well as LGR5 and PROM1 to the expression levels of control HT29 cells. However, DPPIV expression remained high suggesting the involvement of additional transcription factors. The expression of MUC2 may also be controlled by the ATOH1 transcription factor. Induction of ATOH1 expression in HT29 cells resulted in increased MUC2 expression. Furthermore, inhibition of Src family kinases led to a decrease in YAP1 expression as well as an increase in absorptive and goblet cells markers and CDX2 expression. Altogether, this investigation showed that YAP1 negatively regulates the differentiation of both absorptive and goblet cells through the inhibition of the main transcription factor, CDX2.