L’ARN comme intermédiaire de liaison pour un clivage efficace de substrats par la caspase-7

Abstract

L’apoptose est une forme de mort cellulaire programmée qui permet l’élimination des cellules infectées, dysfonctionnelles ou endommagées. Le déclanchement de l’apoptose se fait suite à l’intégration de signaux provenant de l’intérieur ou de l’extérieur de la cellule et résulte en l’activation de caspases initiatrices (caspase-8, -9, -10) qui vont à leur tour activer par clivage les caspases exécutrices (caspase-3, -7). Par la suite, c’est le clivage par ces dernières de substrats clés qui mènera à l’apoptose. Chaque caspase lie des séquences peptidiques dans sa pochette catalytique avec plus ou moins d’affinité et cette séquence peptidique est donc un déterminant important de l’efficacité de clivage. Dans le laboratoire, nous avons découvert que la caspase-7 utilise un exosite afin de sélectionner efficacement un substrat, la poly(ADP-ribose) polymérase 1 (PARP-1). Un exosite est un site de reconnaissance supplémentaire du substrat situé en dehors de la pochette catalytique et qui permet d’augmenter l’efficacité de l’enzyme. Lors de mes études graduées, je me suis intéressé à l’exosite de la caspase-7 (K38KKK) et son interaction avec le substrat PARP-1. Premièrement, grâce à des mutants de l’exosite et des essais protéolytiques, j’ai déterminé que seule la charge positive de l’exosite est importante puisqu’entre autres les substitutions pour des acides aminés négatifs éliminent l’exosite. J’ai ensuite identifié l’ARN comme molécule permettant l’interaction entre l’exosite de la caspase-7 et PARP-1. J’ai démontré que la caspase-7 est capable de lier l’ARN, tout comme PARP-1, et que l’ARN sert en fait de pont entre les deux protéines et permet à la caspase de cliver plus efficacement son substrat dû à leur proximité. Grâce à des analyses de données de spectrométrie de masse et des essais protéolytiques, j’ai démontré que la caspase-7 préfère cliver les substrats liant l’ARN car ce dernier facilite le clivage de six autres protéines liant l’ARN. J’ai aussi caractérisé l’interaction caspase-7/ARN pour révéler que la concentration et la longueur de l’ARN affectent l’efficacité de clivage du substrat lié l’ARN tandis que la séquence ou le type d’ARN n’est pas important puisque la caspase-7 peut lier tous les types d’ARN. J’ai finalement montré que la caspase-7, qui forme un homodimère, peut utiliser ses deux exosites à la fois pour lier de manière optimale l’ARN et que son peptide N-terminal, normalement retiré lors de l’activation durant l’apoptose, réduit l’affinité pour l’ARN. Ces travaux ont permis d’identifier et de caractériser un mécanisme en émergence qui utilise l’ARN comme intermédiaire entre une protéase et ses substrats.

Abstract: Apoptosis is a form of programmed cell death allowing for the removal of infected, dysfunctional, or damaged cells. The onset of apoptosis follows the integration of incoming signals from either the inside or outside of the cell, and leads to the activation of initiator caspases (caspase-8, -9, 10), which will subsequently cleave and activate executioner caspases (caspase-3, -7). Afterwards, cleavage of key substrates by the executioners will lead to full blown apoptosis. Each caspase binds peptidic sequences in their catalytic pocket with more or less affinity and, thus, the peptidic sequence is an important factor for cleavage efficacy. In our laboratory, we discovered that caspase-7 uses an exosite to select its substrate poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1). An exosite is an additional binding site for the substrate located outside of the catalytic pocket that enhances enzymatic efficacy. During my graduate studies, I was interested by the exosite of caspase-7 (K38KKK) and its interaction with PARP-1. First, with exosite mutants and cleavage assays, I determined that the exosite’s positive charge was the sole important factor since substitution with negatively charged amino acids eliminates the exosite effect. Subsequently, I identified RNA as a molecule enhancing the interaction between the exosite of caspase-7 and PARP-1. I demonstrated that like PARP-1, caspase-7 binds RNA and that RNA acts as a bridge between both proteins and allows caspase-7 to cleave more efficaciously its substrates due to their proximity. Using available mass spectrometry data and cleavage assays, we showed that caspase-7 cleaves preferentially substrates which also bind RNA and that RNA bridges six other RNA-binding substrates favoring their cleavage. I also characterized the caspase-7/RNA interaction to find that RNA concentration and length affect the cleavage of a RNA-binding substrate while the RNA sequence or type of RNA do not. Finally, I found that caspase-7, which forms an homodimer, can use its two exosites simultaneously to bind RNA optimally and that its N-terminal peptide, usally removed during apoptosis, reduces affinity for RNA. These experiments allowed the identification and characterization of an emerging mechanism in which RNA is an intermediate between a protease and its substrates.