Lysosphingolipid urine screening test using tandem mass spectrometry for lysosomal storage disorders

Abstract

Abstract: Sphingolipidoses such as Fabry disease, Gaucher disease, Krabbe disease, Niemann-Pick disease, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, metachromatic leukodystrophy and GM1 gangliosidosis are attributed to defective sphingolipid catabolism. This results in neurotoxicity and severe systemic manifestations. Because of the complexity of lysosphingolipid analysis, high-sensitivity techniques with excellent resolution are required to attain reliable analysis of urine samples of affected patients. Currently, there is no robust method using urine to simultaneously analyze a group of lysosphingolipids related to these rare diseases. A non-invasive approach was chosen for a simplified sample collection of biological matrices. The main objective of this research project is to develop/validate a method for the simultaneous analysis of several lysosphingolipids and their analogs in urine using tandem mass spectrometry (MS/MS). Secondary objectives: 1) Analysis of lysosphingolipids in urine samples from patients with the aforementioned diseases and age- and gender-matched controls to establish reference values; 2) Development and adaptation of the method using urine filter paper samples; 3) Technological transfer to the clinic. After sample preparation by solid phase extraction, the samples are analyzed by ultra-high-performance liquid chromatography in combination with MS/MS. Preliminary results are promising with a fast 15-minute multiplex method that analyzes 21 creatinine-normalized biomarkers for 8 diseases. The validation of the method includes measurements of intra- and interday test variations, linearity of the calibration curve, matrix effect, recovery, glass and plasticware adsorption, stability of metabolites at different temperatures, detection and quantification limits. The growing demand to quickly identify patients with different sphingolipidoses and offer time-effective monitoring and follow-up of their treatment is driving this project forward. In conclusion, this methodology will be applied to high-risk screening testing to target patients with various sphingolipidoses and help to understand the cellular neurotoxicity and pathophysiology of the diseases. The application of a urine filter paper sphingolipid method will facilitate storage and shipment at lower costs.

Les sphingolipidoses telles que la maladie de Fabry, la maladie de Gaucher, la maladie de Krabbe, la maladie de Niemann-Pick, la maladie de Tay-Sachs, la maladie de Sandhoff, la leucodystrophie métachromatique et la gangliosidose GM1 sont attribuées à un catabolisme défectueux des sphingolipides. Il en résulte une neurotoxicité et des manifestations systémiques graves. En raison de la complexité de l'analyse des lysosphingolipides, des techniques de haute sensibilité avec une excellente résolution sont nécessaires pour obtenir une analyse fiable des échantillons d'urine des patients atteints. Actuellement, il n'existe pas de méthodes robustes utilisant l'urine pour analyser simultanément un groupe de lysosphingolipides liés à ces maladies rares. Une approche non-invasive a été choisie pour un prélèvement simplifié d'échantillons de matrices biologiques. L'objectif principal de ce projet de recherche est de développer/valider une méthode d'analyse simultanée de plusieurs lysosphingolipides et de leurs analogues dans l'urine par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Objectifs secondaires : 1) Analyse des lysosphingolipides dans des échantillons d'urine provenant de patients atteints des maladies susmentionnées et de témoins appariés en fonction de l'âge et du sexe afin d'établir des valeurs de référence ; 2) Développement et adaptation de la méthode en utilisant des échantillons d'urine sur papier filtre ; 3) Transfert technologique vers la clinique. Après préparation des échantillons par extraction en phase solide, les échantillons sont analysés par chromatographie liquide à ultra-haute performance en combinaison avec MS/MS. Les résultats préliminaires sont prometteurs avec une méthode multiplex rapide de 15 minutes qui analyse 21 biomarqueurs normalisés à la créatinine pour 8 maladies. La validation de la méthode comprend les mesures de variations intra- et inter-journalières du test, la linéarité de la courbe d'étalonnage, l'effet de matrice, la récupération, l'adsorption des articles en verre et en plastique, la stabilité des métabolites à différentes températures, les limites de détection et de quantification. La demande croissante d'identifier rapidement les patients atteints de différentes sphingolipidoses et d'offrir une surveillance et un suivi efficaces de leur traitement est à l'origine de ce projet. En conclusion, cette méthodologie sera appliquée aux tests de dépistage à haut risque pour cibler les patients atteints de différentes sphingolipidoses et aider à comprendre la neurotoxicité cellulaire et la physiopathologie des maladies. L'application d'une méthode de sphingolipides sur papier filtre urinaire facilitera le stockage et l'expédition à moindre coût.