Développement d'un probiotique fonctionnalisé comme antibiotique hautement spécifique

Abstract

La biologie synthétique est une discipline appliquant les principes d’ingénierie à la conception de circuits génétiques complexes ayant pour but d’exercer de nouvelles fonctions non retrouvées dans la nature. Ces approches ont rapidement suscité un grand intérêt dans le domaine médical où bon nombre de systèmes furent créés afin de répondre à des besoins non comblés par des approches classiques. Un des défis médicaux d’importance des prochaines années concerne le traitement des infections bactériennes résistantes aux antibiotiques. L’accumulation rapide de gènes de résistance, combinée au ralentissement des efforts de développement de nouveaux antibiotiques par les compagnies pharmaceutiques menacent de créer une grande crise sanitaire d’ici 2050. Afin de répondre à ce défi, l’utilisation de CRISPR-Cas9 pour éliminer spécifiquement des bactéries résistantes aux antibiotiques fut proposée. En utilisant des approches de biologie synthétique et de génomique, il est maintenant possible d’utiliser Cas9 pour discriminer des souches bactériennes selon leurs séquences d’ADN. En ciblant des séquences uniquement retrouvées dans des souches problématiques (par exemple des gènes de résistance aux antibiotiques, des gènes de virulences, des toxines), il est possible d’éliminer ces bactéries d’un mélange complexe sans affecter les autres membres de la communauté bactérienne. Le principal défi de ce type d’approche concerne la méthode de livraison de CRISPR-cas9. L’efficacité globale du système sera dépendante de la capacité de livraison du complexe CRISPR-cas9 aux cellules cibles. Durant mon doctorat, j’ai travaillé au développement d’un outil de livraison de CRISPR-cas9 hautement performant dans le microbiote entérique. Cet outil exploite la conjugaison bactérienne comme véhicule de livraison des gènes encodant le système CRISPR-Cas9 à des bactéries directement dans l’intestin. Le système CRISPR-cas9 est alors exprimé dans la cellule réceptrice, interroge son génome pour une séquence cible programmable et la clive, menant ainsi à la perte d'intégrité du génome et en la mort de la cellule cible. Afin de développer cet outil, j’ai d’abord effectué le criblage de 13 systèmes conjugatifs pour leur efficacité de transfert d’ADN directement dans l’intestin d’un modèle de souris. Ces criblages m’ont permis d’identifier TP114, un plasmide de la famille d’incompatibilité (Inc) I2 pouvant se transférer à virtuellement toutes les Escherichia coli réceptrices sondés dans nos tests. L’étude de TP114 m’a ensuite permis d’identifier un mécanisme essentiel à la conjugaison bactérienne dans l’intestin, soit la stabilisation de la paire de conjugaison. Chez TP114, ce mécanisme est exercé par un pilus de type IV qui est essentiel pour la conjugaison in situ, mais pas pour la conjugaison sur milieu de culture en agar. J’ai ensuite travaillé sur l’insertion du système CRISPR-cas9 directement dans TP114. Pour ce faire, il me fallait manipuler deux molécules d’ADN pour forcer leur fusion de façon dirigée et sans stimuler la recombinaison homologue afin d’éviter que des systèmes composés de plusieurs ARN guide (ARNg) recombinent sur eux-mêmes et perdent des sections de séquences. Pour ce faire, j’ai mis au point une technique d’assemblage d'ADN in vivo appelé DROID qui utilise la recombinaison site-spécifique dépendante de Bxb1 afin de médier la fusion des deux molécules d’ADN. Ensuite, des sites FRT adéquatement placés permettaient la délétion de marqueurs de résistance aux antibiotiques et autres éléments génétiques superflus. La méthode s’est montrée très efficace et robuste avec des taux de succès d’insertion de >99 %. Finalement, j’ai été en mesure de développer le système COP (COnjugative Probiotic), un probiotique exploitant la grande efficacité conjugative de TP114 in situ dans l’intestin pour mobiliser un système CRISPR-cas9. Après avoir conçu un ARNg ciblant le gène de résistance au chloramphénicol, j’ai ensuite effectué une preuve de concept où un mélange de bactéries cibles et non-cibles était introduit en quantité égale dans le système digestif de la souris. Ce premier système exploitant les capacités naturelles de TP114 a été en mesure d’éliminer 98 % des bactéries cibles en 3 jours. Afin d’améliorer l’efficacité et la dynamique de conjugaison de TP114, j’ai ensuite eu recourt à des techniques d’évolution accélérée afin d’obtenir un mutant de TP114 présentant des performances accrues. Ce système COP amélioré a ensuite atteint une efficacité d’élimination spécifique de 99,5 % en moins de 24 heures avec une seule dose. L’ensemble de ces résultats démontrent le potentiel de la technologie COP comme alternative aux antibiotiques pour le traitement d’infections entériques. Les expériences de preuve de concept ont d’ailleurs permis l’application pour un brevet maintenant en phases nationales et la création d’une entreprise du secteur des biotechnologies. Les données accumulées sur TP114 permettront, dans les travaux futurs, de raffiner le système en lui ajoutant des mesures de bioconfinement et en continuant d’améliorer ses propriétés.