Caractérisation d'une deuxième protéine encodée dans le gène codant pour le récepteur B2 de la bradykinine

Abstract

De récentes études protéomiques et fonctionnelles chez les eucaryotes (www.openprot.org) prédisent la traduction de cadres des lectures ouverts alternatifs (AltORFs) dans les ARNm matures des récepteurs couplés aux protéines G, incluant ceux du récepteur B2 de la bradykinine (B2R). Notre objectif principal était de déterminer l’implication d’une protéine résultante d’un AltORF nouvellement découvert, appelée AltB2R, dans les propriétés de signalisations connues du B2R en utilisant des approches de méthodologies complémentaires. Nous avons prédit une probabilité inférieure à 0.07 % qu’un AltORF de taille similaire à AltB2R apparaisse de façon aléatoire dans le gène du B2R. Lorsqu’exprimé de façon ectopique dans des cellules HeLa, AltB2R a présenté une distribution cytoplasmique/périnucléaire ponctuée prédominante et une co-interaction apparente avec le B2R à la membrane plasmique et aux membranes endosomales/vésiculaires. La présence d’AltB2R augmente la mobilisation du Ca2+ intracellulaire et l’activation d’ERK1/2-MAPK (par phosphorylation) suivant la stimulation du B2R. De plus, des cellules HEK293A exprimant un B2R muté manquant l’expression concomitante d’AltB2R ont affiché des réponses maximales significativement réduites du couplage des protéines Gαq et Gαi2/3¬, de la génération d’IP3, et de l’activation d’ERK1/2-MAPK stimulé par l’agoniste par rapport au B2R sauvage. Inversement, il n’y avait pas de différence dans la densité membranaire du B2R, ainsi que dans ses propriétés de liaison au ligand et dans les efficacités des agonistes apparentés à promouvoir l’internalisation du B2R et le recrutement de la β-arrestine-2. De plus, il n’y avait pas de différence dans la prolifération cellulaire favorisée par la stimulation du B2R lors de l’expression d’AltB2R. De façon importante, le B2R et AltB2R étaient tous deux surexprimés dans les cancers de la prostate et du sein comparés aux tissus normaux, suggérant un nouveau rôle d’AltB2R dans ces maladies. Notre étude montre que le BDKRB2 est un gène multicodant et identifie AltB2R comme un nouveau modulateur positif de certaines voies de signalisation du B2R. Plus généralement, elle supporte aussi un nouveau, protéome alternatif pour les GPCRs, ce qui ouvre de nouvelles frontières dans les champs de la biologie des GPCRs, leurs maladies associées et la découverte de nouvelles drogues.

Abstract : Recent functional and proteomic studies in eukaryotes (www.openprot.org) predict the translation of alternative open reading frames (AltORFs) in mature G protein-coupled receptor (GPCR) mRNAs, including that of bradykinin B2 receptor (B2R). Our main objective was to determine the implication of a newly discovered AltORF resulting-protein, termed AltB2R, in the known signaling properties of B2R using complementary methodological approaches. We predicted a smaller than 0.07 % chance that an AltORF of similar size than AltB2R could randomly appear in the B2R gene. When ectopically expressed in HeLa cells, AltB2R presented predominant punctate cytoplasmic/perinuclear distribution and apparent co-interaction with B2R at plasma and endosomal/vesicular membranes. The presence of AltB2R increases intracellular [Ca2+] and ERK1/2-MAPK activation (via phosphorylation) following B2R stimulation. Moreover, HEK293A cells expressing mutant B2R lacking concomitant expression of AltB2R displayed significantly decreased maximal responses in agonist-stimulated Gαq- Gαi2/3-protein coupling, IP3 generation, and ERK1/2-MAPK activation as compared to wild-type controls. Conversely, there was no difference in cell-surface density as well as ligand-binding properties of B2R and in efficiencies of cognate agonists at promoting B2R internalization and β2-arrestin recruitment. Furthermore, there was no difference in cell proliferation promoted by B2R stimulation following expression of AltB2R. Importantly, both AltB2R and B2R proteins were overexpressed in prostate and breast cancers, compared with their normal counterparts suggesting new associative roles of AltB2R in these diseases. Our study shows that BDKRB2 is a dual-coding gene and identifies AltB2R as a novel positive modulator of some B2R signaling pathways. More broadly, it also supports a new, unexpected alternative proteome for GPCRs, which opens new frontiers in fields of GPCR biology, diseases, and drug discovery.