Étude du mécanisme catalytique de la phosphatase alcaline du placenta humain

Abstract

La phosphatase alcaline du placenta a été purifiée en vue du marquage des sites actifs. L'enzyme obtenue répond aux meilleurs critères de pureté, une activité -spécifique de 424 ?moles x mg -1x min -1,ce qui est la plus haute activité spécifique obtenue pour cette enzyme. L'étude du comportement cinétique montre que l'enzyme possède deux groupements ionisables de pKb 7.70 et pKa 8.70. Le groupement de pKa = 8.70 est probablement associé à l'ionisation d'une molécule d'eau-zinc coordonnée alors que le groupement ~e pKb = 7.70 peut être un groupement thiol ou aminé. L'enzyme présente un maximum d'activité à basse concentration en substrat à pH neutre suggérant une activité d'hydrolase comme fonction physiologique. Nous retrouvons les mêmes caractéristiques remarquées chez l'enzyme bactérienne à savoir une similitude des Vm et Km au pH optimum et pH physiologique. L'étude de l'action du Tris sur l'activité hydrolase et transférase suggère une action du nucléophile au niveau de l'intermédiaire phosphorylé, enzyme-substrat, impliqué dans le changement conformationnel inter sous-unité. D'autre part, les diverses études de marquage des sites actifs montrent que l'enzyme des mannifères possède deux sites actifs bien qu'un seul ne paraisse fonctionner à pH neutre. Parmi tous les mécanismes qui ont été proposés pour tenir compte des propriétés catalytiques de l'enzyme bactérienne, un seul mécanisme, le mécanisme Flip-Flop, permet également de tenir compte des propriétés observées sur l'enzyme des mammifères. Il semble donc que malgré l'évolution qui s 'est effectuée de la bactérie aux mannifères, la phosphatase alcaline a gardé un centre catalytique identique, afin de jouer le même rôle physiologique d'alimenter la cellule en phosphate.