Identification et caractérisation de mécanismes d’action atypiques des petits ARN régulateurs bactériens

Abstract

Les bactéries ont développé un grand nombre d’éléments régulateurs contrôlant l’expression de leurs gènes en réponse aux conditions environnementales. Parmi ceux-ci, on retrouve les petits ARN régulateurs (sRNA), de puissants régulateurs post-transcriptionnels. Leur action permet de remodeler le profil transcriptomique afin d’assurer le maintien de l’homéostasie cellulaire. L’identification de nouvelles cibles des sRNAs pose un défi récurent et pour adresser ce dernier, notre équipe a développé une méthode basée sur la purification d’affinité de l’ARN, que nous avons appelé MAPS. L’objectif des travaux présentés était d’exploiter les données de MAPS afin d’identifier des interactions ARN-ARN atypiques dans les réseaux de régulation des sRNAs RyhB et MicF.

Les données de MAPS de RyhB nous ont permis d’identifier une interaction du sRNA avec un fragment dérivant de la maturation d’un pré-ARN de transfert, le 3’ETSleuZ. Nous avons pu démontrer que le 3’ETSleuZ n’est pas une cible de RyhB, mais agit plutôt comme un ARN sponge. En condition où RyhB n’est pas supposé être exprimé, le 3’ETSleuZ crée un seuil de concentration que le sRNA doit surpasser pour avoir une action régulatrice. De plus, nous avons caractérisé une interaction semblable entre le 3’ETSleuZ et le sRNA RybB, créant un lien direct entre les réseaux de deux sRNAs indépendants.

Les données de MAPS obtenues pour MicF ont guidé l’identification de la première cible positivement régulée par ce sRNA, l’ARNm oppA. La régulation positive survient généralement lorsqu’un sRNA module l’accessibilité de site d’initiation de la traduction ou lorsqu’il stabilise le transcrit. Cependant, le mécanisme d’action de MicF sur oppA est unique. En effet, MicF modifie l’accessibilité d’un amplificateur de traduction, localisé à plus de 100 nucléotides de la séquence codante de oppA. C’est, à notre connaissance, le premier cas rapporté d’un sRNA qui assiste un amplificateur pour réguler l’expression d’une cible. De plus, nos études suggèrent que la régulation de oppA par MicF dépend de la concentration de l’ARNm cible, créant une étroite fenêtre de régulation pour MicF.

Abstract: Throughout evolution, bacteria have evolved a plethora of regulatory elements that act as determinants of gene expression. Among those, small regulatory RNAs (sRNAs) are widely used as powerful post-transcriptional regulators. They act by reshaping the bacterial transcriptome to maintain cellular homeostasis. Identification of new sRNA targets has been a recurring challenge and to address this, our team developed an RNA pull-down technique termed MAPS. The aim of the presented studies was to exploit MAPS data to identify new atypical regulatory events occurring in the networks of RyhB and MicF sRNAs. RyhB is expression under iron-scarce conditions and is a key player of iron homeostasis. MicF is expressed during osmotic stress and helps reshape the protein content of the cell wall. Analyzing the MAPS data of RyhB, we noticed an interaction between the sRNA and transfer RNAs (tRNAs), which had never been characterized before. Further investigations led us to discover that RyhB was interacting with a tRNA-derived fragment, the 3’ external transcribed spacer of leuZ (3’ETSleuZ), released during pre-tRNA maturation. We demonstrate that the 3’ETSleuZ is not a target of RyhB but rather acts as a sRNA sponge. Under non-inducing conditions, the 3’ETSleuZ sets a concentration threshold the sRNA needs to overcome to fulfil its regulatory roles. Moreover, the RybB sRNA is also sponged out by the 3’ETSleuZ, setting a crosstalk between the regulatory networks of two unrelated sRNAs. The MAPS data of MicF led us to identify the first positive target in MicF targetome, the oppA mRNA. Positive regulation often occurs through structural modification of the translation initiation region, or through mRNA stabilization. However, the case of oppA is unique. Indeed, the sRNA modulates the access of a translation enhancing element located more than 100 nucleotides upstream of oppA coding sequence. This is the first example, to our knowledge, of a sRNA assisting a TE to fine-tune gene expression. Furthermore, our studies show that the MicF-dependent regulation of oppA depends on target mRNA concentration, creating a narrow regulatory window for MicF.