Cell-penetrating pepducins as tools to investigate neurotensin receptor-1 signalling and function

Abstract

Abstract : In recent years, new strategies have emerged to more fully exploit the therapeutic potential of G protein-coupled receptors (GPCRs), a protein target class which has known remarkable success in drug discovery. One such strategy is the design of cell-penetrating lipopeptides known as pepducins. Specifically, pepducins are composed of a peptide sequence mimicking one of the intracellular loops of a GPCR of interest, conjugated to an N-terminal palmitic acid. This lipid moiety effectively anchors the pepducin to the cell membrane and facilitates its translocation into the cell, where it interacts with its cognate GPCR at the receptor-effector interface. Thus, the pepducin may behave as an allosteric agonist or allosteric modulator of its cognate receptor. In this study, we generated a series of pepducins targeting the first intracellular loop of the human neurotensin receptor type 1 (hNTS1), a GPCR shown to mediate many of the physiological effects of the neurotensin (NT) tridecapeptide, including analgesia, hypotension, and hypothermia. Our goal was to create a novel set of tools to investigate the signalling and function of the hNTS1 receptor, thereby validating the pepducin approach for a new receptor target. We characterized the signalling signature of our pepducin series using label-free whole-cell assays to monitor pepducin-induced changes in dynamic mass redistribution. BRET-based biosensors were then used to determine the pepducins’ ability to engage G protein-dependent and G protein-independent signalling pathways, and to affect receptor homomerization. Finally, the pepducins’ impact on NT orthosteric binding was assessed using a radioligand binding assay. In CHO-K1 cells stably expressing hNTS1, we observed distinct surface plasmon resonance (SPR) profiles in a pepducin-stimulated (10-5 M) cell monolayer, similar to those obtained through Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS). We also determined that our pepducins’ could engage G-protein-dependent, but not G-protein-independent, pathways at concentrations exceeding 10-5 M. Intriguingly, they could furthermore inhibit NT-induced ß-arrestin recruitment in a concentration-dependent manner, and promote receptor homomerization. Finally, high pepducin concentrations partially inhibited orthosteric NT binding, but, importantly, the non-palmitoylated control did not do so. Preliminary in vivo data also indicate that our pepducins trigger important blood pressure drops in carotid artery-cannulated rats (55 nmol/kg, i.v.), and that one pepducin, at least, could reduce pain sensitivity to acute thermal noxious stimuli (275 nmol/kg, i.t.). Altogether, these pepducins may constitute valuable tools to get a better understanding of which signalling pathways are associated to the physiological responses of hNTS1, or may even be used as novel therapeutic drugs to modulate receptor function.

Afin de mieux exploiter le potentiel thérapeutique des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), de nombreuses stratégies novatrices ont récemment été introduites, dont celle des pepducines. Les pepducines sont des lipopeptides composés d’une séquence peptidique mimant une boucle intracellulaire d’un RCPG d’intérêt, conjugée à un acide palmitique en position N-terminale. Le groupement lipide permet l’insertion et l’ancrage de la pepducine à la membrane cellulaire, permettant ainsi sa translocation vers l’intérieur de la cellule. La pepducine interagit alors avec la région intracellulaire de son RCPG cible et agit comme agoniste allostérique ou comme modulateur allostérique de celui-ci. Dans cette étude, notre équipe a généré une série de pepducines mimant la première boucle intracellulaire du récepteur humain de la neurotensine de type 1 (hNTS1), un RCPG impliqué dans plusieurs effets physiologiques de la neurotensine (NT), dont l’analgésie, l’hypotension et l’hypothermie. Notre objectif était de créer des outils novateurs pour l’étude de la signalisation et de la fonction de hNTS1 et, par ce fait même, de valider l’approche des pepducines dans un système non-ciblé jusqu’à présent. Tout d’abord, nous avons caractérisé la signature signalétique de nos pepducines à l’aide d’essais cellulaires label-free qui mesurent la redistribution de masses dans une couche cellulaire stimulée par nos pepducines. Par la suite, nous avons utilisé des biosenseurs BRET pour déterminer le potentiel des pepducines à moduler l’activité des voies de signalisation G-dépendantes et G-indépendantes, et à influer sur la dimérisation du récepteur. Finalement, nous avons évalué l’impact des pepducines sur la liaison orthostérique d’un ligand NT radiomarqué. Dans des cellules CHO-K1 exprimant hNTS1 de manière stable, et à des concentrations élevées (10-5 M), nous avons observé des profils SPR distincts pour chacune de nos pepducines, similaires à ceux obtenus par mesure d’impédance. Nous avons également démontré que ces pepducines activent les voies protéines G-dépendantes (mais pas la voie des arrestines), qu’elles peuvent inhiber le recrutement des ß-arrestines induit par la NT, et, en outre, promouvoir l’homomérisation de hNTS1. Aussi, les pepducines, mais pas le contrôle non-palmitoylé, ont partiellement inhibé la liaison de la NT radiomarquée. Des résultats préliminaires in vivo soulignent la capacité des pepducines à induire une chute de pression artérielle chez le rat (55 nmol/kg, i.v.) et à réduire la réponse douloureuse provoquée par un stimulus thermique (275 nmol/kg, i.t.). En conclusion, ces pepducines pourraient servir d’outils novateurs pour mieux comprendre les voies de signalisation associées aux effets physiologiques du récepteur NTS1 ou encore être exploitées directement pour leur capacité à moduler l’activité NTS1.