L’altération peptidique de l’activité GTPasique de Rab4, un premier pas vers le développement d’inhibiteurs de la GTPase

Abstract

La petite GTPase Rab4 est un membre de la superfamille des GTPases Ras. De concert avec une panoplie d’autres protéines, elle régule le recyclage entre la membrane plasmique et l’endosome précoce. Son association avec une prostaglandine synthase, la L-PGDS, a été précédemment démontrée au laboratoire. L-PGDS active Rab4 in vitro et in cellulo via l’accélération de son cycle de chargement en GTP. Ces deux protéines coopèrent dans le recyclage du récepteur aux prostaglandines type-D 1 (DP1) à la membrane plasmique. Sachant ainsi que Rab4 interagit directement avec L-PGDS et que cette interaction entraine l’activation de la GTPase, l’objectif de mon projet fut de créer une gamme de peptides basés sur la séquence d’interaction L-PGDS/Rab4, et ce dans le but d’affecter l’activité de Rab4, dont l’expression est élevée dans divers cancers. Nous avons donc procédé à la synthèse de divers peptides sur phase solide, dans le but d’évaluer leur effet sur Rab4. Nous avons également mis à l’épreuve une panoplie de méthodes de quantification des effets sur Rab4 entraînés par l’ajout de ces peptides. Nous avons premièrement réalisé des pulldowns par affinité ainsi que des essais de chargement en GTPgS de Rab4. Nous avons exploité la fluorescence des tryptophanes de Rab4 afin de sonder l’évolution de son état de chargement nucléotidique à travers le temps. Ces expériences nous ont permis d’extraire des constantes de vitesse de la réaction de chargement. Nous avons effectué des expériences d’anisotropie de fluorescence afin de quantifier l’affinité des peptides envers Rab4. Nous avons également procédé à la purification de Rab4 radiomarquée afin d’effectuer des expériences de résonance magnétique nucléaire (RMN) de protéine en solution, nous permettant de caractériser la structure de Rab4 et l’effet des peptides sur celle-ci. De plus, nous avons réalisé des expériences de protéomique de Rab4 et de ses mutants afin d’identifier de nouveaux partenaires potentiels. Nous avons également entamé le design d’un biosenseur FRET de Rab4, dans l’optique d’utiliser celui-ci pour en apprendre davantage sur la localisation cellulaire de la Rab4 active. En tout et partout, ces expériences nous ont permis d’identifier les acides aminés Q88, C89 et E90 de L-PGDS comme des éléments cruciaux pour son effet activateur de Rab4. Nous avons également pu identifier les acides aminés de Rab4 qui sont affectés par la liaison du peptide WT 85-92. Pour conclure, cette présente étude a permis de faire un premier pas dans le design rationnel d’inhibiteurs de Rab4, tout en développant des méthodes et outils utiles pour la caractérisation des effets de ceux-ci.