Identification de la région catalytique de la chitosanase de Streptomyces SP. N174 par mutagénèse dirigée

Abstract

L' Actinomycète Streptomyces N174 a été isolé pour la première fois dans le laboratoire du docteur Brzezinski. Cette souche a été retenue parmi une cinquantaine d'autres souches isolées du sol à cause de sa très grande facilité à dégrader le chitosane. Le gène de la chitosanase de Streptomyces N174 a par la suite été cloné puis la purification de la protéine a été accomplie. Pour parvenir à purifier la chitosanase, plusieurs formulations de milieux de culture et de conditions ont dû être essayées pour réussir à produire la protéine en quantité suffisante pour effectuer toutes les analyses nécessaires à son étude. L'étude de la structure tridimensionnelle de la chitosanase a pu être concrétisée grâce aux techniques de cristallisation. L'objectif de notre travail a consisté à identifier par mutagénèse dirigée les acides aminés responsables de la fonction catalytique de la chitosanase de Streptomyces sp. N174. Nos travaux, ainsi que d'autres travaux effectués dans ce laboratoire, ont montré que cette enzyme appartient à la famille 46 des glycosyl hydrolases. L'information concernant les acides aminés essentiels pour cette classe d'enzymes n'est pas connue. Cependant, chez les glycosyl hydrolases en général, la majorité des acides aminés catalytiques sont des résidus carboxyliques conservés dans des régions où les séquences en acides aminés sont très similaires. L'analyse par ordinateur et la comparaison des séquences en acides aminés de quatre chitosanases procaryotiques a révélé que les régions N-terminales de ces protéines avaient une très haute homologie entre-elles. Parmi les acides aminés conservés dans ces quatre séquences, on retrouve cinq acides aminés carboxyliques. Afin de vérifier si ces acides aminés avaient une importance dans l'activité catalytique de la chitosanase de Streptomyces N174, ces cinq résidus ont été remplacés par des acides aminés stériquement conservatif ou fonctionnellement conservatif par une méthode de mutagénèse dirigée. Les différentes protéines mutantes ont été obtenues puis purifiées. Une série de tests tel que la détermination des paramètres cinétiques et la visualisation des protéines sur gel d'électrophorèse a été faite pour caractériser ces protéines mutantes. Une étude de dichroïsme circulaire a confirmé que les pertes d'activités observés dans les différentes protéines mutantes n'étaient pas dus à un changement de la structure secondaire de la protéine. À la suite de cette étude, il était intéressant de comprendre l'interaction entre l'acide aminé catalytique et l'acide aminé situé le plus près dans le voisinage de l'acide aminé catalytique. Nous avons donc procéder à une autre série de mutations par mutagénèse dirigée où l'acide aminé R205 a été muté en quatre différents résidus. Cette étude nous a permis de mieux comprendre les interactions entre cet acide aminé et l'acide aminé catalytique.