Impact génétique des pHs suboptimaux

Abstract

Les cassures bicaténaires sont les dommages les plus dangereux pour une cellule puisque ceux-ci peuvent conduire à la perte de matériel génétique, à la perte de phénotype et à la mort cellulaire. Ces lésions à l’ADN peuvent être la conséquence de l’action néfaste de produits de mécanismes biologiques naturels, comme les espèces réactives de l’oxygène par exemple. L’exposition à certains facteurs exogènes peuvent également être responsable de la formation de cassures bicaténaires, comme l’irradiation ionisante ou le rayonnement ultraviolet. La variation physiologique locale du pH extracellulaire peut être considéré comme un facteur exogène lorsqu’elle résulte d’un stress conduisant à une fluctuation des ions hydrogènes dans le microenvironnement cellulaire. Afin de caractériser l’effet de variations locales du pH extracellulaire (pHe) sur la l’intégrité génétique, nous avons débuté par étudier leurs effets sur la réponse aux dommages à l’ADN et sa réparation. À l’aide de la bléomycine, un agent radiomimétique, des cassures bicaténaires ont été induites dans une culture primaire de fibroblastes en culture. La récupération a été effectuée pendant 24 heures et 48 heures à différents pHe physiologiques, appelés pHe suboptimaux, soit de 7.2 à 6.9. L’apparition et le suivi des cassures bicaténaires induites ont été observés à l’aide d’immunofluorescences et d’immunobuvardages contre la phosphorylation de l’histone H2AFX, un marqueur de remodelage de la chromatine, et contre la protéine 53BP1, un régulateur de la réponse cellulaire lors de cassures bicaténaires. Accompagné de tests de proliférations cellulaires, nous avons déterminé que l’incubation à pHe suboptimal induisait une baisse d’efficacité de la réparation des cassures bicaténaires de l’ADN. L’utilisation de puces PCR nous a également permis de mettre en évidence des baisses d’expressions de différents gènes impliqués dans la phase présynaptique et synaptique de la recombinaison homologue. Nous avons également déterminé que cette baisse d’efficacité pouvait induire des aberrations chromosomiques par la détection de micronoyaux. Cette instabilité chromosomique induite par les pHe suboptimaux a été d’avantage caractérisée à l’aide d’une culture cellulaire immortalisée lymphoblastoïde humaine, les cellules TK6. Suite à trois semaines d’incubation à pHe 7.2 et 6.9, une perte d’hétérozygotie pour le gène TK1 a été détectée par séquençage d’amplicons et des défauts d’épissage ont été observés par ASPCR. Enfin, par séquençage à haut débit des ARNm, nous avons pu déterminer que l’acidification modérée du pHe induisait des modifications du transcriptome. L’ensemble de ces résultats ont permis de démontrer pour la première fois que la variation physiologique localisé du pHe peut induire de l’instabilité génétique avec un potentiel mutagène chez des cellules saines.

Abstract : Double-strand breaks are the most dangerous type of damage for a cell because they can lead to loss of genetic material and cell death. These DNA lesions can be the result of damaging agents from natural biological mechanisms such as reactive oxygen species. Exposure to exogenous factors, like ionizing irradiation or ultraviolet radiation, can also be responsible for the formation of double-strand breaks. A physiological variation in extracellular pH (pHe) in a cell’s microenvironment can also be considered as an exogenous factor when it results in stress leading to the fluctuation of hydrogen ions in that environment. The genotoxic impact of small pHe variations has never been investigated. In order to characterize the effects of local variations in extracellular pH on genetic integrity, we first investigated its impact on both DNA damage response and DNA repair. Using bleomycin, a radiomimetic agent, double-strand breaks were induced in a primary culture of fibroblasts. The recovery was done for 24 hour and 48 hour periods in different physiological pHe, termed suboptimal pHe, from 7.2 to 6.9. The appearance and progress of the induced double-strand breaks were observed by immunofluorescence and immunoblots with antibodies against the phosphorylation of the H2AFX histone, a marker of chromatin remodeling, and against the 53BP1 protein, a regulator of the cellular response to doublestrand breaks. In addition to the cellular proliferation tests, we established that the incubation in suboptimal pHe induced a decrease in the DNA double-stand breaks repair efficiency. The use of PCR chips also allowed us to highlight decreases in the expression of different genes involved in the pre-synaptic and synaptic phase of homologous recombination. Based on micronuclei detection, we showed that the decreased efficiency of DNA repair resulted in chromosomal aberrations. This chromosomal instability induced by suboptimal pHe was further characterized by using a cell culture of immortalized human lymphoblastoids, TK6 cells. Following three weeks of incubation at 7.2 and 6.9 pHe, a loss of heterozygosity for the TK1 gene was detected by amplicon sequencing and splicing defects were observed by ASPCR. Finally, mRNA sequencing by next-generation sequencing was used to determine that moderate acidosis of the pHe induces transcriptome modifications. Together these results allowed us to demonstrate for the first time that the physiological local variations of pHe can induce genetic instability with a mutagenic potential in healthy cells.