Localisation nucléaire de la carnitine acétyltransférase

Abstract

Le gamète mâle est caractérisé par un génome extrêmement compacté, permettant le maintien de l’intégrité génétique nécessaire à la fécondation et à la transmission des informations paternelles. Un remodelage de la chromatine important des cellules germinales a lieu lors de la phase haploïde de la spermatogenèse, la spermiogenèse. Plusieurs étapes se succèdent pour passer d’une chromatine somatique nucléosomale à une chromatine condensée grâce aux petites protéines basiques que sont les protamines. Une des premières étapes primordiales est l’acétylation globale des histones et en particulier de l’histone H4. La recherche systématique de l’histone acétyltransférase responsable n’a pas permis de mettre en évidence un candidat potentiel. Dans cette étude, la source de l’acétyl-CoA nécessaire à cette hyperacétylation a été investiguée suite à l’observation de la localisation nucléaire de la carnitine acétyltransférase (CrAT) dans les spermatides de souris. CrAT est une enzyme qui catalyse la réaction réversible de transformation de l’acétylcarnitine en acétyl-CoA et pourrait donc produire le substrat indispensable à l’acétylation des histones lors de la spermiogenèse. La localisation nucléaire de CrAT a été confirmée par immunofluorescences sur des coupes testiculaires murines et humaines et s’avère coïncidée avec l’hyperacétylation de l’histone H4. CrAT est principalement connue pour être une protéine mitochondriale et peroxysomale. Chez l’humain, le variant peroxysomal (pCrAT) est issu d’un épissage alternatif et ne contient pas le signal de localisation mitochondriale. Dans cette thèse, le clonage des deux variants de CrAT et leur transfection transitoire dans des cellules HeLa et des fibroblastes primaires ont permis de confirmer la localisation nucléaire de pCrAT lorsque le signal de localisation peroxysomale est masqué par une étiquette (FLAG ou eGFP) ou délété. La mutation des trois acides aminés basiques d’un signal de localisation nucléaire monopartite potentiel, prédit au milieu de la protéine, ainsi que sa délétion, empêche la localisation nucléaire de pCrAT. Le rôle nucléaire de CrAT n’a pu être démontré dans une lignée cellulaire stable ou dans un modèle d’invalidation conditionnelle chez la souris, mais ces expériences fournissent des pistes de solution pour de futures optimisations. Les recherches se sont longtemps attardées aux enzymes responsables des modifications post-traductionnelles, mais de plus en plus d’intérêt est porté à la disponibilité de leur substrat. La majorité de ces substrats, comme l’acétyl-coA, est issu du métabolisme cellulaire et ces travaux sur la carnitine acétyltransférase représentent de nouveau le lien entre le métabolisme et l’épigénétique.

Abstract : The male gamete is characterised by an extremely compacted genome, which promotes the necessary maintenance of genetic integrity for proper fertilization and transmission of paternal information. This chromatin remodeling necessary for compaction of germ cells takes place during the haploid phase of spermatogenesis termed, spermiogenesis. Several differentiation steps are required to transform the somatic nucleosomal chromatin into a condensed chromatin through the action of small basic proteins, called protamines. One of the first most important steps is the global acetylation of histones, especially histone H4. A systematic search of a histone acetyltransferase involved in the process yielded no potential candidate. In this study, a likely source for the required acetyl-CoA has been investigated following the observation that carnitine acetyltransferase (CrAT) was found localized to the nucleus of mouse spermatids. CrAT is an enzyme which reversibly catalyses the transformation of acetylcarnitine into acetyl-CoA and could therefore produce the substrate essential for histones acetylation during spermiogenesis. The nuclear localization of CrAT has been confirmed by immunofluorescence on murine and human testis sections and shown to be coincident with the onset of histone H4 hyperacetylation. CrAT is primarily known to be a mitochondrial and peroxisomal protein. In human, the peroxisomal variant of CrAT (pCrAT) derived from alternative splicing and lacks the mitochondrial targeting signal. In this thesis, cloning and transient transfection of both variants of CrAT in HeLa cells and primary fibroblasts confirm CrAT nuclear localization, when peroxisomal targeting signal is hindered by a tag (FLAG or eGFP) or deleted. Mutation of the three basics amino acids of a putative monopartite nuclear localization signal, predicted in the middle of the protein sequence, as well as its deletion, prevented CrAT nuclear localization. The nuclear role of CrAT could not be established with a stable cell line or by using a conditional knockout mouse model, but these experiments provided important hints to improve results in following attempts. Research have long been focused on post-translational modifications enzymes, but their substrate availability is increasingly taken into consideration. Most of these substrates, like acetyl-CoA, are produced from cellular metabolism and this work on carnitine acetyltransferase sets the stage for an original investigation on the link between metabolism and epigenetic.