Caractérisation intégrative et développement d’outils moléculaires chez la bactérie "Mesoplasma florum"

Abstract

L’émergence de la biologie synthétique marque l’entrée dans une nouvelle ère où il sera possible de modifier et reprogrammer des génomes entiers afin de répondre à des besoins spécifiques. Ce domaine de recherche est par conséquent appelé à jouer un rôle de premier plan dans le développement de nouvelles technologies visant à s’attaquer à certains des plus grands défis du 21e siècle tels que la multirésistance aux antibiotiques, la production d’énergies renouvelables et le traitement de maladies comme le cancer ou le diabète. Notre habileté actuelle à programmer des comportements cellulaires prévisibles est cependant très limitée, principalement parce que les organismes modèles couramment utilisés possèdent une complexité qui dépasse nos capacités d’analyse et que les règles fondamentales qui gouvernent le fonctionnement global des cellules demeurent encore mal comprises. En raison de leurs génomes remarquablement petits, les bactéries appartenant à la classe des Mollicutes représentent des candidats particulièrement intéressants afin de décortiquer le fonctionnement intégral de cellules via les approches intégratives de la biologie des systèmes et de la génomique synthétique. La majorité de ces microorganismes sont toutefois caractérisés par un style de vie parasitaire, des capacités métaboliques réduites et une croissance relativement lente nécessitant l’utilisation de milieux de culture complexes. Conjointement au manque d’outils génétiques efficaces, ces caractéristiques restreignent considérablement leur manipulation en laboratoire. Certains Mollicutes se démarquent néanmoins en tant qu’organismes modèles pour l’avancement de la biologie synthétique et de la biologie des systèmes. C’est le cas pour Mesoplasma florum, une bactérie étroitement apparentée aux mycoplasmes du groupe de Mycoplasma mycoides (mycoides cluster). Contrairement à la plupart des mycoplasmes, M. florum ne possède aucun pouvoir pathogène connu et croît rapidement en conditions de laboratoire. De plus, M. florum possède un génome comprenant seulement 793 224 paires de bases et 685 séquences codantes pour des protéines, ce qui positionne cette bactérie parmi les organismes à réplication autonome les plus simples connus à ce jour. Malgré ces avantages considérables, seulement quelques études avaient jusqu’à tout récemment spécifiquement exploré la biologie de M. florum, et ce même si sa découverte remonte à près de 40 ans. Ainsi, lors du commencement de mon doctorat, plusieurs aspects importants concernant ce microorganisme demeuraient toujours à définir. Par exemple, pratiquement aucune donnée quantitative sur la physiologie de cette bactérie était à ce moment-là disponible dans la littérature, et aucune étude sur l’expression de ses gènes n’avait encore été entreprise. De plus, très peu voire même aucun outil moléculaire n’était disponible afin de modifier le génome de M. florum, ce qui constituait une limitation technique importante à l’étude de la biologie de cet organisme, en plus de restreindre son utilisation en tant que châssis cellulaire pour l’ingénierie microbienne et le développement d’applications biotechnologiques. Face à cette problématique, j’ai tout d’abord développé un système de culture en continu flexible et peu dispendieux permettant de faire croître M. florum dans des conditions contrôlées, stables et hautement reproductibles. Cet appareil offre plusieurs modes de fonctionnement pour accommoder les différents besoins rencontrés en laboratoire, et nous avons rendu les détails de sa conception entièrement disponibles pour l’ensemble de la communauté scientifique. En diminuant les fluctuations physiologiques des cellules, ce système de culture permet de réduire les variations expérimentales lors de l’étude de M. florum, et ainsi de générer des données plus facilement interprétables et comparables entre expériences. J’ai ensuite développé les tout premiers plasmides spécifiquement conçus pour se répliquer chez M. florum. Basés sur l’origine de réplication du chromosome, ces plasmides ont permis de tester la fonctionnalité de différents marqueurs de sélection aux antibiotiques, en plus de mettre au point différentes méthodes de transformation pour cette bactérie. Grâce à leur tendance naturelle à recombiner avec le chromosome, ces plasmides ont d’ailleurs servi de fondement à la technique développée par notre laboratoire afin de cloner le génome complet de M. florum dans la levure. Cette souche de levure peut maintenant servir de plateforme afin de modifier efficacement le génome de M. florum et ensuite le transplanter dans une cellule réceptrice. Finalement, j’ai procédé à la caractérisation approfondie de cette bactérie quasi minimale en combinant différentes méthodes expérimentales et approches intégratives. Cette caractérisation intégrative comprend la mesure de plusieurs aspects physiques et physiologiques propres à M. florum, incluant son temps de doublement, diamètre cellulaire, masse cellulaire sèche, ainsi que la définition des fractions macromoléculaires de celle-ci. J’ai également réalisé les premières analyses du transcriptome et du protéome de ce microorganisme afin de définir les unités transcriptionnelles, estimer les abondances moléculaires absolues de chacun des transcrits et protéines exprimées, de même qu’évaluer l’importance globale des fonctions cellulaires prédites. En plus d’augmenter nos connaissances fondamentales sur différents aspects de la biologie de M. florum, ces efforts de caractérisation serviront de fondation pour le développement d’un modèle à l’échelle du génome décrivant le métabolisme de cette bactérie. L’ensemble de ces efforts visent à acquérir les connaissances et les outils moléculaires nécessaires afin de transformer M. florum en une plateforme simplifiée, hautement caractérisée et spécialement conçue pour explorer les règles gouvernant l’organisation et la plasticité des génomes, ainsi que les mécanismes cellulaires à la base du fonctionnement des cellules. Une telle plateforme a le potentiel de transformer la biologie synthétique en une discipline logique, prévisible et reproductible, rendant ainsi possible le prototypage rationnel et efficace de génomes dans le but de produire des souches bactériennes capables d’accomplir des tâches bien précises.