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Other titre : RAB21 functional interactome characterisation

dc.contributor.advisorJean, Steve
dc.contributor.authorDel Olmo, Tomasfr
dc.date.accessioned2020-05-08T15:32:16Z
dc.date.available2020-05-08T15:32:16Z
dc.date.created2020fr
dc.date.issued2020-05-08
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11143/17016
dc.description.abstractLe trafic membranaire régule l’ensemble du transport vésiculaire de cargos entre les différents organites de la cellule ainsi qu’avec le milieu extracellulaire. On distingue les voies de sécrétion et d’endocytose mais celles-ci sont interconnectées. Ce trafic est un réseau complexe qui assure l’intégrité cellulaire. Une panoplie de protéines agissent donc en concert afin de permettre sa régulation. Les RAB sont considérées comme les chefs d’orchestre du trafic. Activées, elles recrutent une large gamme d’effecteurs qui permettent de médier chacune des étapes du trafic membranaire. Des défauts d’activité des RAB sont impliqués dans le développement de pathologies telles que les maladies neurodégénératives et le cancer. RAB21 est une RAB endosomale impliquée dans la régulation de l’internalisation des intégrines, du récepteur à l’EGF et dans la régulation du flux autophagique. Cependant, peu d’effecteurs et régulateurs sont connus pour RAB21. En effet, la compréhension des mécanismes moléculaires d’action des RAB reste un enjeu majeur dans le décryptage du trafic membranaire. En effet, l’identification des partenaires protéiques des RAB comporte de nombreuses limitations. Ici, la combinaison d’une approche de spectrométrie de masse quantitative (SILAC) avec une approche de marquage par proximité (APEX2) a permis d’identifier l’ensemble des partenaires protéiques de RAB21. L’approche APEX2 a permis d’identifier la plupart des interacteurs connus de RAB21 ainsi que de nouveaux effecteurs et régulateurs potentiels. La comparaison des enrichissements relatifs aux RAB5, 4, 7 et 21 a permis d’identifier des interactions spécifiques à chacune des RAB. L’approche SILAC a permis l’identification de cargos potentiels. La validation des interactions identifiées par des techniques de biochimie ont validé l’interaction de RAB21 avec les complexes WASH et Rétromère, impliqués dans des évènements de tri endosomal, ainsi qu’avec TMED10 qui régule la progression de cargos le long de la voie de sécrétion. Par la suite, la délétion de RAB21 par l’approche CRISPR/Cas9 a mis en évidence un rôle de RAB21 dans la stabilité du Rétromère et dans l’activité de WASH. La déplétion de RAB21 affecte le recyclage de cargos clathrine indépendants à la membrane plasmique. Par ailleurs, la délétion de RAB21 affecte la stabilité et la localisation au Golgi de TMED10. L’ensemble de ces travaux ont permis de caractériser de nouveaux effecteurs et cargos spécifiques ainsi que deux nouvelles fonctions impliquant RAB21. Ce projet a permis d’établir de nouvelles approches expérimentales pour élucider les mécanismes moléculaires de régulation du trafic membranaire et pourra servir de base à l’étude de l’ensemble des RAB.fr
dc.description.abstractAbstract: Membrane trafficking regulates vesicular transport between the different organelles of the cell as well as exchanges with the extra-cellular space. Endocytic and secretory pathways are interconnected and form a complex network assuring cell integrity. Therefore, membrane trafficking is regulated by a large set of proteins which all act in concert to enable its proper function. RABs are considered as master regulators of trafficking. When activated, RABs recruit a wide range of effectors to mediate each steps of trafficking. Impairment of RAB activity are involved in the development of diseases such as neurodegenerative diseases and cancer. RAB21 is an endosomal RAB which regulates autophagic flux and is involved in the internalization of integrins and the EGF receptor. Despite these identified functions, only a few effectors and regulators are known for RAB21. Understanding the molecular mechanisms of action of RABs remains a major challenge to decode membrane trafficking. Indeed, identification of RABs partners with current approaches has some limitation. Here, the combination of a quantitative mass spectrometry (SILAC) approach with a proximity labeling approach (APEX2) made it possible to identify almost every RAB21 protein partners. The APEX2 approach allowed the identification of most of the known RAB21 interactors as well as potential effectors and regulators. The comparison of the relative protein enrichments obtained with RAB5, 4, 7 and 21 permitted to identify specific interactions. The SILAC approach has essentially allowed the identification of potential cargos for RAB21. Biochemical techniques validated the interactions of RAB21 with the WASH and Retromer complexes, both involved in endosomal sorting events, as well as with TMED10 which regulates the cargoes progression through secretory pathway. Subsequently, the deletion of RAB21 by CRISPR/Cas9 highlighted a role for RAB21 in maintaining the stability of the retromer complex and in regulating WASH complex activity. The deletion of RAB21 affected recycling of clathrin-independent-cargos to the plasma membrane. In addition, deletion of RAB21 decreased the stability of TMED10 and its location at Golgi. All this work allowed the characterization of new specific effectors and cargos as well as two new functions involving RAB21. This project is an example in the study of the molecular mechanisms of membrane trafficking regulation that can be used as a basis for the study of all RABs.fr
dc.language.isofrefr
dc.publisherUniversité de Sherbrookefr
dc.rights© Tomas Del Olmofr
dc.subjectRAB21fr
dc.subjectAPEX2fr
dc.subjectSILACfr
dc.subjectRétromèrefr
dc.subjectWASHfr
dc.subjectTMED10fr
dc.subjectTrafic membranairefr
dc.subjectMembrane traffickingfr
dc.titleCaractérisation fonctionnelle de l’interactome de RAB21fr
dc.title.alternativeRAB21 functional interactome characterisationfr
dc.typeThèsefr
tme.degree.disciplineBiologie cellulairefr
tme.degree.grantorFaculté de médecine et des sciences de la santéfr
tme.degree.levelDoctoratfr
tme.degree.namePh.D.fr


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