Identification de partenaires d'interaction de l'exosite de la caspase-7
Other titre : Identification of binding partners for the caspase-7 exosite
Publication date
2020Author(s)
Bilodeau-Laforest, Marie-Anne
Subject
ApoptoseAbstract
Les caspases forment une famille de protéases à cystéine impliquées dans plusieurs types de
mort cellulaire programmée, comme l’apoptose, une mort cellulaire essentielle au maintien
de l’homéostasie du corps permettant, entre autres, le remplacement d’une cellule
défectueuse par une nouvelle en seulement quelques heures. Les caspase-3 et -7 sont les
caspases principalement responsables de l’exécution de l’apoptose; la caspase-3 étant perçue
comme la principale en raison de son activité intrinsèque plus élevée. Cependant, la caspase-
7 semble avoir un rôle plus spécialisé puisqu’elle clive plus efficacement certains substrats
grâce à un exosite. Un exosite est un domaine de liaison supplémentaire se trouvant à
l’extérieur de la pochette catalytique de l’enzyme. L’exosite de la caspase-7 est constitué
principalement de quatre résidus lysine (K38KKK) formant une région chargée positivement
qui lui permet de lier les substrats PARP-1 et p23 afin d’augmenter l’efficacité de clivage.
Notre hypothèse est donc que l’exosite de la caspase-7 permette de lier différentes structures
ou protéines dans la cellule. Notre but était donc d’identifier certains substrats de la caspase-
7 qui interagissent avec son exosite. Pour se faire, nous avons testé et optimisé cinq
approches de spectrométrie de masse. Sur les cinq, deux approches nous ont permis
d’identifier des substrats potentiels de la caspase-7. La première approche consistait en un
clivage in vitro d’extraits cellulaires marqués à l’aide d’isotopes (SILAC) suivi d’une analyse
en spectrométrie de masse de type shotgun et nous a permis d’établir une liste de protéines
interagissant potentiellement avec l’exosite de la caspase-7. Certaines cibles prometteuses
ont ensuite été validées. Nous avons confirmé que la Thymidylate synthase (TYMS) est
clivée par la caspase-3, mais ne semble pas l’être par la caspase-7. Le récepteur du facteur
de croissance fibroblastique (FGFR1) semble être clivé par les caspases, mais nous n’avons
pas pu le valider avec certitude. Puisque cette approche n’a pas permis l’identification de
nouveaux substrats de la caspase-7, une autre méthode a été établie qui consistait en un
clivage in cellulo dans des cellules apoptotiques suivi d’un enrichissement des produits de
clivage par la procédure TAILS et une analyse en spectrométrie de masse. Cette méthode a
permis d’identifier dix protéines potentiellement clivées plus efficacement par la caspase-7.
Enfin, basé sur des évidences provenant de la littérature, nous avons également tenté de
confirmer si certains isoformes de la Protéine kinase C (PKC) clivés par la caspase-7
pouvaient interagir avec son exosite, mais sans succès. Notre hypothèse reste toujours à
confirmer, par contre, l’étude des rôles cellulaires de ces substrats potentiels pourra nous
éclairer sur la fonction spécialisée de la caspase-7, mais d’autres réplicas devront être faits. Abstract: Caspases are a family of cysteine proteases involved in several types of programmed cell
death, such as apoptosis, an essential cell death process used to maintain homeostasis of the
body consisting in the replacement of a defective cell by a new one in just a few hours.
Caspase-3 and -7 are the proteases mainly responsible for the execution of apoptosis;
caspase-3 is thought to be the key caspase because of its higher intrinsic activity. However,
caspase-7 seems to have a more specialized role since it can cleave certain substrates faster
because of an exosite. An exosite is an additional binding domain located outside the
catalytic pocket of an enzyme. The caspase-7 exosite is primarily composed of four lysine
residues (K38KKK) and forms a positively charged region that allows it to bind PARP-1 and
p23 to increase their cleavage efficacy. We propose that the exosite of caspase-7 can bind
different structures or proteins in the cell. Our goal was to identify among the substrates of
caspase-7 those that interact with the exosite. To do so, we have tested and optimized five
methods using mass spectrometry. Of the five, two methods allowed us to identify proteins
potentially cleaved by caspase-7. The first method consisted of in vitro cleavage of
metabolically-labeled cell extracts (SILAC) followed by a shotgun mass spectrometry
analysis. With this method, we established a list of proteins potentially interacting with the
caspase-7 exosite. Then, the most promising targets based on SILAC quantification and on
protein function have been validated. We have confirmed that Thymidylate synthase
(TYMS) is cleaved by caspase-3 but does not seem to be a caspase-7 substrate. Also,
Fibroblast growth factor receptor (FGFR1) was another potential substrate of caspases, but
it could not be confirmed with certainty. Since protein validation did not permit the
identification of new caspase-7 substrates, another method was developed that consisted of
in cellulo cleavage in apoptotic cells followed by enrichment of cleavage peptides by the
TAILS method and a mass spectrometry analysis. This method allowed us to identify ten
proteins that are potentially cleaved more rapidly by caspase-7 than by caspase-3. Also,
based on evidence from the literature, we tried to confirm if some isoforms of Protein kinase
C (PKC) cleaved by caspase-7 could interact with its exosite, but did not succeed. Our
hypothesis remains unvalidated, but the cellular function of these substrates could enlighten
us on the specialized role of caspase-7, but further replicas of this method are needed.
Collection
- Moissonnage BAC [3206]
- Médecine et sciences de la santé – Mémoires [1602]
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