Identification de partenaires d'interaction de l'exosite de la caspase-7

Abstract

Les caspases forment une famille de protéases à cystéine impliquées dans plusieurs types de mort cellulaire programmée, comme l’apoptose, une mort cellulaire essentielle au maintien de l’homéostasie du corps permettant, entre autres, le remplacement d’une cellule défectueuse par une nouvelle en seulement quelques heures. Les caspase-3 et -7 sont les caspases principalement responsables de l’exécution de l’apoptose; la caspase-3 étant perçue comme la principale en raison de son activité intrinsèque plus élevée. Cependant, la caspase- 7 semble avoir un rôle plus spécialisé puisqu’elle clive plus efficacement certains substrats grâce à un exosite. Un exosite est un domaine de liaison supplémentaire se trouvant à l’extérieur de la pochette catalytique de l’enzyme. L’exosite de la caspase-7 est constitué principalement de quatre résidus lysine (K38KKK) formant une région chargée positivement qui lui permet de lier les substrats PARP-1 et p23 afin d’augmenter l’efficacité de clivage. Notre hypothèse est donc que l’exosite de la caspase-7 permette de lier différentes structures ou protéines dans la cellule. Notre but était donc d’identifier certains substrats de la caspase- 7 qui interagissent avec son exosite. Pour se faire, nous avons testé et optimisé cinq approches de spectrométrie de masse. Sur les cinq, deux approches nous ont permis d’identifier des substrats potentiels de la caspase-7. La première approche consistait en un clivage in vitro d’extraits cellulaires marqués à l’aide d’isotopes (SILAC) suivi d’une analyse en spectrométrie de masse de type shotgun et nous a permis d’établir une liste de protéines interagissant potentiellement avec l’exosite de la caspase-7. Certaines cibles prometteuses ont ensuite été validées. Nous avons confirmé que la Thymidylate synthase (TYMS) est clivée par la caspase-3, mais ne semble pas l’être par la caspase-7. Le récepteur du facteur de croissance fibroblastique (FGFR1) semble être clivé par les caspases, mais nous n’avons pas pu le valider avec certitude. Puisque cette approche n’a pas permis l’identification de nouveaux substrats de la caspase-7, une autre méthode a été établie qui consistait en un clivage in cellulo dans des cellules apoptotiques suivi d’un enrichissement des produits de clivage par la procédure TAILS et une analyse en spectrométrie de masse. Cette méthode a permis d’identifier dix protéines potentiellement clivées plus efficacement par la caspase-7. Enfin, basé sur des évidences provenant de la littérature, nous avons également tenté de confirmer si certains isoformes de la Protéine kinase C (PKC) clivés par la caspase-7 pouvaient interagir avec son exosite, mais sans succès. Notre hypothèse reste toujours à confirmer, par contre, l’étude des rôles cellulaires de ces substrats potentiels pourra nous éclairer sur la fonction spécialisée de la caspase-7, mais d’autres réplicas devront être faits.

Abstract: Caspases are a family of cysteine proteases involved in several types of programmed cell death, such as apoptosis, an essential cell death process used to maintain homeostasis of the body consisting in the replacement of a defective cell by a new one in just a few hours. Caspase-3 and -7 are the proteases mainly responsible for the execution of apoptosis; caspase-3 is thought to be the key caspase because of its higher intrinsic activity. However, caspase-7 seems to have a more specialized role since it can cleave certain substrates faster because of an exosite. An exosite is an additional binding domain located outside the catalytic pocket of an enzyme. The caspase-7 exosite is primarily composed of four lysine residues (K38KKK) and forms a positively charged region that allows it to bind PARP-1 and p23 to increase their cleavage efficacy. We propose that the exosite of caspase-7 can bind different structures or proteins in the cell. Our goal was to identify among the substrates of caspase-7 those that interact with the exosite. To do so, we have tested and optimized five methods using mass spectrometry. Of the five, two methods allowed us to identify proteins potentially cleaved by caspase-7. The first method consisted of in vitro cleavage of metabolically-labeled cell extracts (SILAC) followed by a shotgun mass spectrometry analysis. With this method, we established a list of proteins potentially interacting with the caspase-7 exosite. Then, the most promising targets based on SILAC quantification and on protein function have been validated. We have confirmed that Thymidylate synthase (TYMS) is cleaved by caspase-3 but does not seem to be a caspase-7 substrate. Also, Fibroblast growth factor receptor (FGFR1) was another potential substrate of caspases, but it could not be confirmed with certainty. Since protein validation did not permit the identification of new caspase-7 substrates, another method was developed that consisted of in cellulo cleavage in apoptotic cells followed by enrichment of cleavage peptides by the TAILS method and a mass spectrometry analysis. This method allowed us to identify ten proteins that are potentially cleaved more rapidly by caspase-7 than by caspase-3. Also, based on evidence from the literature, we tried to confirm if some isoforms of Protein kinase C (PKC) cleaved by caspase-7 could interact with its exosite, but did not succeed. Our hypothesis remains unvalidated, but the cellular function of these substrates could enlighten us on the specialized role of caspase-7, but further replicas of this method are needed.