The nucleus of human vascular smooth muscle cells contains nuclear t-tubules and nucleoplasmic reticulum and regulates its own calcium homeostasis

Abstract

Abstract: The accumulating knowledge about the cell nucleus, as of today, describes it as a complex, dynamic organelle of the cell, harboring, commending and mediating multitude of biological processes crucial for the life and death of the cell. This definition is starkly different from the initial belief, that the nucleus is a mere sac contaning the genomic material. One of the important cellular phenomena involving the nucleus is cellular Ca2+ homeostasis. Previous work in our laboratory bas demonstrated that the nucleus plays an important role in modulating cytosolic Ca2+ homeostasis in many cell types. Nevertheless, the issue of nuclear Ca2+ homeostasis regulation is a matter of scientific dispute. Therefore, the objective of this thesis project was to test the hypothesis, that nuclear Ca2+ homeostasis regulation can be dependent and independent of cytosolic Ca2+. Using numerous detection techniques made possible by the confocal microscope, coupled to utilization of appropriate ionic indicators, we showed that in intact spontaneously contracting cardiomyocytes, spontaneous Ca2+ sparks and waves exist in the cytosol and at the perinuclear area. Furthermore, we showed, for the first time, that isolated nuclei bathed in a cytosolic medium are able to generate their own spontaneous Ca2+ transients, the occurrence of which does not depend on the open state of the nuclear pore. On the other hand, when isolated nuclei were stimulated with ET-1, nuclear Ca2+ puffs and/or sparks were generated, which eventually grew into transient waves. It is notable, that such transients were also generated by ET-1 stimulation even in absence of Ca2+ from the bathing extranuclear medium. Furthermore, again in zero cytosolic Ca2+ conditions, localized intra-nuclear Ca2+ oscillations were detected, and were resolved by the Line-scan technique of the confocal microscope. Our results also demonstrate that at least some of the detected Ca2+ transients could be due to Ca2+ mobilization from nuclear IP3 and Ryanodine sensitive pools. We also investigated the presence of intra-nuclear entities, which could participate in regulation of nuclear Ca2+ homeostasis. Utilizing various organelle detecting probes and 3D confocal microscopy, our studies demonstrate the presence of two kinds of nuclear structures in human vascular smooth muscle cells (hVSMCs). First, an ER-like nuclear structure, which is a resident nuclear entity and possesses Glucose-6- phosphatase activity. It is endowed by Ca2+-ATPases, IP3 and Ryanodine receptors. Second, nuclear tubular structures, which appear to be invaginations of the nuclear envelope membranes into the nucleoplasm, possess nuclear pores and bear Ca2+-ATPase pumps. They seem to contain Ca2+ and to date exhibit a GPCR, the AT2 receptor of Ang II. These nuclear tubular invaginations seem to be dynamic in nature and are absent from isolated nuclei. Taking into consideration the fact, that cytosolic and perinuclear Ca2+ transients can propagate to the nucleus, and because spontaneous and pharmacologically induced Ca2+ sparks, puffs and waves can occur in isolated nuclei bathed in cytosolic medium, we can conclude that cytosolic Ca2+ seems to be important in regulation of nuclear Ca2+ homeostasis. However, on the other hand, since nuclear Ca2+ transients and sub-nuclear Ca2+ oscillations could be generated in zero cytosolic Ca2+ conditions, this suggests that nuclear Ca2+ can possess the ability to regulate itself independently of cytosolic Ca2+. In conclusion, nuclear Ca2+ can be regulated both dependently and independently of cytosolic Ca2+ and the newly identified nuclear structures have the potential of playing an important role in this regulation.||Résumé: De plus en plus le noyau de la cellule se défini comme étant une organelle complexe et dynamique, qui porte, commande et médie des multitudes de processus biologiques cruciaux pour la vie et la mort de la cellule. Cette définition est complètement différente du dogme initiale, i.e. que le noyau est seulement un sac contenant de la matière génomique. Le calcium est établit comme un second messager universel, qui médie directement et indirectement la majorité des processus cellulaire, L’un des phénomènes cellulaires important impliquant le noyau est l'homéostasie du Ca2+ intracellulaire. Les travaux précédents effectués dans notre laboratoire ont démontré que le noyau joue un rôle important dans la modulation de l'homéostasie du Ca2+ cytosolique dans plusieurs types de cellules. D'une part, l'homéostasie du Ca2+ nucléaire est un domaine en soi, donné le fait que beaucoup de processus sensibles au Ca2+ résident au noyau, et les signaux et l'homéostasie du Ca2+ nucléaires peuvent avoir des conséquences biologiques distinctes en ce qui concerne les signaux et l'homéostasie du Ca2+ cytosoliques. Néanmoins, la question de la régulation de l'homéostasie du Ca2+ nucléaire demeure toujours un sujet à controverse. Par conséquent, l'objectif de cette thèse est de tester l'hypothèse que la régulation de l'homéostasie du Ca2+ nucléaire est à la fois dépendent et indépendant du Ca2+ cytosolique. Nous avons démontré dans les cardiomyocytes qui se contractent spontanément que les étincelles des 'sparks' calcique spontanés existent dans le cytosol et dans la région périnucléaire. Nous avons aussi montré, pour la première fois, que les noyaux isolés qui baignent dans un milieu ionique mimant le cytosol peuvent produire leurs propres 'sparks' spontanés de Ca2+, dont l'occurrence ne dépend pas de l'état ouvert du pore nucléaire. D'autre part, quand des noyaux isolés sont stimulés avec l'ET-1, des étincelles de types calciques 'puffs' et/ou 'sparks' nucléaires ont été produites, qui se sont par la suite développées en vagues transitoires. Il est à noter, que ces signaux ont été également produits par stimulation avec l'ET-1 même en absence de Ca2+ dans le milieu extranucléaire. De plus, en absence du Ca2+ cytosolique, ont été détectées des oscillations de Ca2+ intranucléaires localisées. Nos résultats démontrent également qu'au moins certains des signaux nucléaires du Ca2+ pourraient être dû à la mobilisation de Ca2+ des réserves nucléaires sensibles à l'IP3 et à la Ryanodine. Nous avons également étudié la présence des entités intranucléaires qui pourraient participer à la régulation de l'homéostasie du Ca2+ nucléaire. Nos études ont démontré la présence de deux types de structures nucléaires dans les cellules du muscle lisse vasculaires humaines (CMLVhs). La première, une structure nucléaire semblable au réticulum endoplasmique, qui est une entité nucléaire locale, et qui possède une activité du glucose-6-phosphatase et qui possède les pompes des Ca2+-ATPases, des récepteurs à l'IP3 et à la ryanodine. La deuxième, des structures tubulaires nucléaires, qui semblent être des invaginations des membranes de l'enveloppe nucléaire vers le nucléoplasme, et qui possèdent des pores nucléaires, des pompes Ca2+-ATPases et le récepteur AT2 de l'Ang II. Ces invaginations tabulaires nucléaires semblent être dynamiques par nature et sont absents dans les noyaux isolés. En prenant en considération le fait que des vagues calciques cytosoliques et perinucléaires peuvent se propager au noyau et parce que des signaux calciques de type 'puffs' et 'sparks' spontanés ou pharmacologiquement induit peuvent se produire dans des noyaux isolés qui baignent dans un milieu mimant le cytosol, nous pouvons conclure que le Ca2+ cytosolique semble être important dans la régulation de l'homéostasie calcique nucléaire. De plus, puisque les signaux calciques et les oscillations nucléaires du Ca2+ peuvent être produits en absence du Ca2+ cytosolique, ceci suggère que le Ca2+ nucléaire possède la capacité de se réguler indépendamment du Ca2+ cytosolique. En conclusions, nos résultats montre que, le Ca2+ nucléaire peut être régulé dépendamment et/ou indépendamment du Ca2+ cytosolique, et que les structures nucléaires nouvellement identifiées ont le potentiel de jouer un rôle important dans cette régulation.