Validation de sondes fluorescentes ciblant l’apoptose pour l’imagerie pulmonaire par microendoscopie confocale

Abstract

Introduction : La biopsie pulmonaire demeure la méthode optimale pour établir le diagnostic d’une atteinte pulmonaire qui oriente la prise en charge du patient. Cette opération invasive peut occasionner d’importants effets secondaires et sollicite du temps et des ressources importantes. La microendoscopie confocale par fluorescence (MECF) combinée avec des sondes(s) fluorescente(s) pourrait pallier ces inconvénients en permettant d’imager les tissus à l’échelle cellulaire et de discriminer une ou plusieurs activités biochimiques pertinentes. Objectif final : Valider in vitro, in cellulo et in vivo des sondes fluorescentes expérimentales (KcapQ, KcapQ2gen et Cy5-London) qui ciblent l’activité de la caspase 3 pour imager l’apoptose dans un contexte de syndrome de détresse respiratoire aigüe (SDRA) et de cancer pulmonaire non à petites cellules (CPNPC). Méthodes : In vitro : Les sondes ont été incubées avec différentes caspases recombinantes et la vitesse initiale de clivage, v0, a été calculée. In cellulo : Les lignées H1299 et A549 (lignées épithéliales respiratoires cancéreuses de type adénocarcinome) traitées à la staurosporine (STS), un inhibiteur des kinases qui est un inducteur d’apoptose caspase 3 dépendante, et au Z-VAD-(OMe)-FMK, un inhibiteur de caspase, ont été utilisées comme modèles cellulaires apoptotiques. L’activité de la caspase a été mesurée par FACS et visualisée par microscopie chez ce modèle. In vivo : L’imagerie par MECF a été réalisée chez le rat dans deux modèles : CPNPC traités au cisplatin et chez un modèle d’inflammation exposé au lippopolysaccharide (LPS). Le succès de l’implantation des cellules pour les modèles CPNPC (A549-GFP et H1299-GFP) a été validé ex vivo et par tomodensitométrie (TDM). Résultats : In vitro, les sondes sont clivées préférentiellement par caspase 3. Les méthodes de détection des fragments de la sonde Cy5-London ne permettent pas d’obtenir des résultats reproductibles. In cellulo : Le modèle cellulaire apoptotique est au point. Les sondes ne permettent pas de différencier les cellules apoptotiques des cellules saines. Les analyses ex vivo et les images TDM montrent une implantation réussie des cellules A549-GFP, mais pas des H1299-GFP. Conclusion : La méthodologie in vitro et in cellulo est au point. In vivo, les travaux sont en cours au niveau de l’élaboration du modèle CPNPC. Il est possible d’imager le poumon par voie endoscopique bien que les sondes Cy5-London, KcapQ et KcapQ2gen ne sont pas de bonnes candidates pour l’imagerie de l’apoptose par MECF.