Caractérisation de l’internalisation constitutive du récepteur aux opioïdes de type delta.

Abstract

Le récepteur opioïde delta (DOP), un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), est impliqué dans la régulation de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques (nociception, anxiété, dépression, etc.). En ce sens, il suscite de plus en plus d’intérêt de la part du milieu académique et des compagnies pharmaceutiques. DOP est exprimé de façon ubiquitaire mais est essentiellement présent à l’intérieur des cellules avec une faible expression à la surface cellulaire. Cette localisation particulière pourrait expliquer pourquoi les agonistes du DOP génèrent peu d'effets analgésiques in vivo. Toutefois, il est possible sous certaines conditions (inflammation ou traitement chronique à la morphine) de potentialiser les effets de ces agonistes chez l’animal. Ces effets s’accompagnent d’une augmentation de la densité du récepteur à la surface des cellules. Bien que DOP soit internalisé suivant son activation par un agoniste, il a été observé qu’il était également constitutivement internalisé dans les cellules. Cependant, la caractérisation et régulation de cette voie d’internalisation de DOP est encore peu décrite. Dans le cadre de mes travaux, nous proposons l’hypothèse que l’internalisation constitutive serait un mécanisme capable de moduler l’expression de DOP à la surface cellulaire. Dans des cellules HEK293, exprimant de façon stable Flag DOP, nous avons tout d’abords confirmé l’internalisation constitutive du récepteur. Des expériences d'immunofluorescences avec des marqueurs de Rab ont montré qu’après son internalisation, DOP colocaliserait avec des marqueurs d’endosome précoce Rab5 et de recyclage rapide Rab4. De plus, des co-immunoprécipitations ont révélé une possible interaction entre DOP et ces Rab. D’autre part, l’utilisation d’un mutant inactif de Rab5 a montré une altération de l’internalisation du DOP. Ces résultats suggèrent que l’internalisation constitutive du DOP serait Rab5-dépendante. Enfin, les niveaux de DOP à la surface des cellules ont été diminués à la suite de la déplétion de Rab4A par un DsiARN, suggérant un recyclage constitutif Rab4-dépendant. La déplétion de Rab4A atténuerait également la signalisation du DOP à la suite de son activation par un agoniste. En parallèle, pour identifier de nouveaux partenaires d’interaction du DOP, nous avons utilisé la technologie de biotinylation de proximité (Bio-ID) par la biotine ligase BirA*. De nombreux candidats ont pu ainsi être identifiés. À plus long terme, nos résultats pourraient permettre le développement de nouvelles stratégies pour limiter l’internalisation ou augmenter le recyclage constitutif du DOP. Cela permettrait d’augmenter les niveaux membranaires du DOP et ainsi potentialiser les effets des agonistes delta dans le traitement de pathologies, incluant le traitement de la douleur.