Standardisation d'un modèle in vitro pour l'étude du métabolisme et de la sécrétion du surfactant pulmonaire

Abstract

Au cours du présent travail nous avons standardisé un modèle in vitro pour l'étude de la sécrétion du surfactant pulmonaire. La procédure suggérée implique d'abord une perfusion de l'organe et un lavage bronchoalvéloaire. Les poumons sont ensuite prélevés et tranchés à l'aide d'un sectionneur de tissu en coupes d'environ 0.75 mm d'épaisseur. Approximativement 200 mg de tissu sont introduits dans des vials de plastique contenant 5 ml d'une solution de Krebs Ringer phosphate (KRP) enrichi d'acides aminés, de glucose et de 0.1 mM fluorure de phényl méthyl sulfonyl (PMSF). Cet inhibiteur s'est avéré important pour garder l'intégrité du tissu. Les études histologiques nous ont montré que dans nos conditions d'incubation la morphologie était bien préservée. Le pourcentage de libération de lactate déhydrogénase (LDH) dans le milieu reste inférieur à 1% du contenu tissulaire total. La cinétique de sécrétion des protéines et de la phosphatase alcaline (PAL) est linéaire durant les 120 min d'incubation. Les études électrophorétiques des produits sécrétés dans les milieux d'incubation semblent indiquer qu'il y aurait deux protéines l'une de 11 kDa et l'autre de 38 kDa qui feraient partie du surfactant pulmonaire. Elles n'ont pas d'équivalence dans le sérum du même animal. Nos études ont montré que la concentration de choline présente dans les milieux d'incubation a une influence sur le captage et l'incorporation de la 3H-choline, alors qu'elle n'en a pas sur le captage ou l'incorporation de la 3H-leucine. La cinétique du captage de la 3H-choline atteint un plateau à 60 min d'incubation alors que son incorporation dans les phospholipides continue d'augmenter. Le tissu pulmonaire capte près de 70% de la 3H-leucine pendant les 15 premières minutes d'incubation pour ensuite ralentir progressivement durant les 90 min suivantes. L'incorporation de leucine dans les protéines est constante sans atteindre de plateau. Dans nos conditions, les poumons de rats mâles adultes, ne répondent pas au β-17-estradiol. Aucun effet n'a été observé sur le captage et l'incorporation des 2 précurseurs radioactifs ci-haut mentionnés. Ces travaux de standardisation ont permis de définir plusieurs paramètres importants dans les systèmes de production du surfactant pulmonaire in vitro. Ce modèle est d'application relativement facile exigeant un minimum d'équipement et peu de temps de préparation. De plus, il est possible d'utiliser les poumons d'un seul animal, de les fragmenter et de les exposer à différentes conditions. Notre travail attire l'attention sur des paramètres qui sont généralement non considérés dans ces études in vitro par exemple la présence d'inhibiteur des protéases et la concentration des substrats métaboliques tels que la choline et la leucine.