Culture organotypique d'intestin de souris adulte : recherche des conditions nécessaires à une préservation optimale du métabolisme

Abstract

L'étude des développements techniques réalisés en culture organotypique et l'analyse des différents facteurs capables d'influencer le comportement du tissu "in vitro" nous ont permis d'évaluer l'importance d'un environnement contrôlé et d'un milieu de culture adéquat. Différentes conditions d'environnement ont été recherchées pour le maintien en culture de l'intestin de souris adulte (Swiss ICR). Suite à des observations morphologiques et à des estimations de l'activité fonctionnelle s'échelonnant sur une période de 48 heures, l'identification d'un environnement optimal fut possible. Nos résultats démontrent donc: 1. Que l'adaptation du petit intestin de souris adulte est possible en culture et ce malgré les échecs relevés par certains chercheurs. 2. Que les conditions de culture utilisées influencent fortement le comportement des explants intestinaux et que plus particulièrement les exigences nutritionnelles de l'intestin de souris adulte impliquent un apport plus riche en acides aminés et une concentration en glucose de 4.5 g/1. 3. Que la présence de sérum est nécessaire à la viabilité soutenue des explants et qu'une concentration de 10% s'est avérée optimale. 4. Que la préservation morphologique des explants est assurée pour une période de 48 heures avec les milieux DMEM-Hépès et DMEM-Hépès-NCTC-135. 5. Que des nouvelles conditions "in vitro" découlent certaines altérations structurales prenant la forme de a) grandes vacuoles supranucléaires; b) d'une augmentation des corps tubulo-vésiculaires et des corps denses ; c) l'apparition de particules glycogéniques; d) la présence d'inclusions denses dans les mitochondries. 6. Que l'activité proliférative des explants diminue durant les 12 premières heures de culture suivi d'une récupération à 24 heures et d'un niveau presque normal d'activité à 48 heures. 7. Que le patron de migration à 24 et 48 heures est sensiblement le même que le contrôle "in vivo". 8. Que le nombre de cellules synthétisant l'ADN est aussi plus faible dans les premières heures de culture pour ensuite se maintenir à 11% de la valeur contrôle jusqu'à 48 heures. 9. Qu'une expansion du compartiment prolifératif est observée à deux heures de culture. Ce compartiment se limite à la partie moyenne de la crypte après six heures. La localisation des sites de synthèse d'ADN se compare à l'animal "contrôle" après 24 et 48 heures de culture. 10. Que les sites de synthèse des protéines se localisent au niveau des cellules épithéliales des cryptes et des villosités et dans les éléments cellulaires de la lamina propria. A 24 heures de culture, l'intensité du marquage, après incorporation de Leu (3H) est la même qu'au départ de la culture, suggérant une capacité d'absorption non modifiée. 11. Que la localisation ultracytochimique d'enzymes caractéristiques de la bordure en brosse (Phosphatase alcaline) du réticulum endoplasmique (glucose-6-phosphatase) et des lysosomes (phosphatase acide) se compare à celle des explants non cultivés. 12. Que les explants d'intestin adulte sont relativement indépendants d'apport hormonal et plus spécifique ment de l'insuline qui ne semble pas nécessaire au maintien de l'intégrité structurale et à la récupération de l'activité proliférative. Cependant, cette hormone semble prendre part au processus de différentiation comme indiqué par la réactivité plus forte des cellules caliciformes au PAS. 13. Que l'atropine (.4 mg/ml), en vertu de son activité anticholinergique ne s'avère pas efficace à inhiber la forte sécrétion intestinale de mucus en culture organotypique. 14. Que la cytochalasine B (5 ug/ml) provoque en une heure l'apparition de masses amorphes paraissant provenir de fragments de microfibrilles le long de la partie interne de la membrane plasmique basale des cellules de la crypte. Ces lésions n'apparaissent pas dans les cellules absorbantes de la villosité. Après 3 et 6 heures de culture, la plupart des cellules de la crypte se détachent de la lamina propria et se nécrosent. 15. Que l'enrichissement du milieu avec de la pentagastrine (.5 ug/ml) - améliore l'architecture des villosités probablement en ralentissant l'affaissement de ces dernières; - augmente de façon significative l'activité mitotique après 48 heures de culture; - élimine les fortes fluctuations du nombre de cellules en phase "S" observées chez le "contrôle" aux différents temps de culture mais n'augmente pas le % de l'indice de marquage (du moins aux périodes où nous l'avons enregistré); - ne provoque pas de modifications importantes des sites de synthèse d'ADN quand comparé au "contrôle" sauf qu'après 6 heures de culture le compartiment prolifératif est plus étendu; - ne modifie pas le patron de migration tel qu'observé chez le "contrôle" sans pentagastrine.