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dc.contributor.advisorLamy, François
dc.contributor.authorBaurain, Roger
dc.date.accessioned2019-01-23T19:37:51Z
dc.date.available2019-01-23T19:37:51Z
dc.date.created1975
dc.date.issued1975
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11143/14707
dc.description.abstractDans ce travail, une nouvelle méthode de dégradation de l'élastine est décrite et les peptides obtenus sont comparés a ceux obtenus par d'autres méthodes de dégradation, non spécifiques. La composition en acides aminés des fractions obtenues par la digestion de l'élastine à l'aide d'acide oxalique nous apprend qu'il y a une relation précurseur-produit entre d'une part la deshydrolysinonorleucine et le produit de condensation aldolique de deux allysines, et d'autre part les isodesmosines. Nous montrons également que chaque (iso)desmosine lie seulement deux chaînes peptidiques et que le poids moléculaire des chaînes entre liens pontiques est de v6000 daltons. Les résultats s'accordent avec le modèle de Gray pour la biosynthèse des (iso)desmosines, que nous avons intégrés dans un modèle plus général de la fibrillogénèse. Le poids moléculaire des fractions obtenues par l'acide oxalique révèle que des peptides de poids moléculaires multiples d'environ 4500 daltons sont solubilisés et que ces peptides ont tendance à s'autoassocier sous l'effet de la pression. Les poids moléculaires des fragments solubilisés par les deux enzymes élastolytiques : l'élastase et la chymotrypsine-D sont compris entre 2000 et 20,000 daltons mais avec prépondérance d'une espèce à ~6000 daltons. Il n'y a pas de différence significative dans la taille des peptides obtenus par les deux enzymes, bien que leur spécificité soit différente. La chymotrypsine-D rompt les liens peptidiques adjacents aux tyrosines et des sites de spécificité secondaire existent. Quand l'élastine est acétylée, la spécificité de l'enzyme est accrue, la vitesse d'élastolyse étant plus lente et les peptides relachés, plus gros. L'acétylation de l'élastine augmente l'affinité de l'élastase pour son substrat mais la vitesse d'élastolyse est plus lente. Les groupes acétyls, mimant peut-être les chaînes latérales des alanines, agissent comme pièges à élastase. Nous avons montré également que le pic élué sur l'analyseur d'acides aminés et généralement baptisé "desmosine", n'est pas pur et que par chromatographie sur papier ce composé se résolvait en 7 bandes dont 3 avaient le spectre d'absorption de la desmosine et qu'une quatrième bande était fluorescente. Au cours de la préparation des (iso)desmosines, 3 autres composés ont été isolés et partiellement caractérisés: le composé "Y" identifié au composé "A285" Franzblau et 2 autres les composés C et D produits ayant des ressemblances avec les (iso)desmosines. La photolyse du noyau pyridinium s'effectue par ouverture du cycle et production de groupes carboxyles. Sous azote la photolyse s'arrête après un certain temps et l'accumulation d'un intermédiaire absorbant a 290nm en résulte. La concentration influence la vitesse de photolyse, qui est d'ordre un mais n'influence ni le rendement photochimique ni la susceptibilité photochimique du noyau pyridinium. La position de substituants sur le cycle influence le spectre d'absorption ainsi que le rendement photochimique a 254nm des composés méthylés de l'ion pyridinium. Les (iso)desmosines se photolysent également suivant une cinétique d'ordre un, qui s'accompagne de la production d'un intermédiaire absorbant à ~420nm. Les spectres d'action ne se superposent pas aux spectres d'absorption, la longueur d'onde optimale pour la photolyse de la desmosine étant de 274nm et de 285nm pour l'isodesmosine. La différence entre les spectres d'action de la desmosine et de l'isodesmosine peut être mise à profit pour dégrader spécifiquement l'isodesmosine à 291nm. La vitesse de photolyse des (iso)desmosines est plus rapide aux pH inférieurs à 9. Aux pH <4, au moins quatre aminés primaires sont détectées parmis les produits de photolyse. L'une d'elle, la lysine résulte du clivage des 2 liens C = N du noyau pyridinium. Le mécanisme proposé pour la production de lysine implique l'hydratation du noyau pyridinium pour former la 2-hydroxy 1,2 dihydro(iso)desmosine qui s'oxyderait en présence d’oxygène dissous en dérivé 2-pyridone. Ce dernier subirait une réaction de Norrish, type I pour former un amino aldehyde à chaine ouverte. Une protonation de celui-ci et une seconde addition d'une molécule d'eau sur l'énamine conduirait à un composé instable qui se décompose pour donner de la lysine. Entre pH 4 et 9, où les chaînes latérales ont des charges positives et négatives, 2 molécules de desmosines peuvent s'approcher et former des photodimères. A pH 9, la déprotonation des groupes aminés des chaînes latérales fait glisser légèrement le spectre d'absorption des (iso)desmosines et cause une diminution importante de la vitesse apparente de photolyse. L'irradiation â 254nm et à pH 2 de l'élastine est plus rapide sous oxygène que sous azote. Sous oxygène la dispersion a une allure coopérative et peut s'interpréter comme étant la solubilisation de fragments ayant absorbés 6 photons. Après 120 heures plus de 95% de l'élastine est solubilisée (2.5g). Les peptides ont des poids moléculaires compris entre 4500 et 30,000 daltons et l'analyse des acides aminés révèle que les (iso)desmosines et tyrosines sont détruites. En plus de la rupture des (iso)desmosines, il, y a donc rupture de la chaîne peptidique, probablement par transfert d'énergie des tyrosines aux liens peptidiques voisins. Sous azote, la dispersion est linéaire et semble résulter du clivage, de façon séquentielle de la chaîne peptidique. Les peptides solubilisés après 560 heures (23 jours) ont des poids moléculaires plus faibles: 1200 daltons et plus, et l'analyse des acides aminés révèle que tous les acides aminés absorbant l'U.V. sont détruits. Quelle que soit la méthode de dégradation utilisée (chimique, enzymatique ou photolyse à 254nm), des peptides d'environ 4500 daltons sont produits. Ceci est consistant avec l'idée selon laquelle l'élastine serait constituée de séquences alternées de peptides hydrophobes et de peptides hydrophiles. Les peptides hydrophobes d'environ 4500 daltons constituent des zones insensibles tandis que les zones hydrophiles contiennent les liens pontiques ainsi que les liens peptidiques susceptibles d'être clivés chimiquement et enzymatiquement. Finalement nous avons montré également que l'élastine pouvait être clivée photochimiquement par de la lumière monochromatique émise à 280nm et que les peptides solubilisés se comportaient sur gel d'électrophorèse comme des entités distinctes de ~14000 et 28000 daltons. Il semble donc, qu'en plus de la rupture des (iso) desmosines, il y a la rupture d'un nombre très limité de liens peptidiques et que la photolyse fournisse actuellement la méthode la plus spécifique pour l'obtention de fragments solubles à partir d'élastine.
dc.language.isofre
dc.publisherUniversité de Sherbrooke
dc.rights©Roger Baurain
dc.titleDégradation controlée de l'élastine par photolyse : comparaison avec les autres méthodes de dégradation
dc.typeThèse
tme.degree.disciplineBiochimie
tme.degree.grantorFaculté de médecine et des sciences de la santé
tme.degree.levelDoctorat
tme.degree.namePh.D.


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