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Chymotrypsine A de porc : purification et étude cinétique

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Bergeron_Louise_MSc_1974.pdf (3.100Mb)
Publication date
1974
Author(s)
Bergeron, Louise
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Abstract
La purification de la chymotrypsine A de porc s'effectue principalement en trois étapes. D'abord, une extraction acide du pancréas sélectionne les protéines résistantes à la dénaturation irréversible, en milieu fortement acide (pH * 2.0). Une précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium limite la préparation à quatre constituants majeurs. Ensuite, le principe de chromatographie par affinité est exploité pour isoler la chymotrypsine A active. L'enzyme est jugée pure par le critère d'homogénéité sur gel de polyacrylamide en milieu acide. Deux ligands sont utilisés: la phényl-4, butylamine et l'ester méthylique de l'e-amino-n-caproyl, D-tryptophane. Il est démontré que l'adsorption de la chymotrypsine sur ces colonnes est non spécifique et qu'un gradient de force ionique et/ou de pH est nécessaire pour séparer les différentes espèces retenues. Ainsi, la chromatographie dite d'affinité ne diffère pas de la chromatographie d'adsorption classique lorsque le ligand interagit avec une constante de dissociation de l'ordre du millimolaire. L'hydrolyse de l'ester éthylique de la N-acétyl, L-tyrosine, catalysée par la chymotrypsine A de porc, est mesurée au pH-stat et les paramètres Vm et Km sont déterminés en fonction du pH. L'activité de l'enzyme est contrôlée par deux groupes ionisables dont les pK apparents sont 5.73 et 9.58. Le pK de 5.73 se retrouve à la fois sur l'enzyme libre et sur l'acyl-enzyme et correspond probablement à l'histidine du site actif. Le pK de 9.58 se retrouve sur l'enzyme libre et lors de la fixation du substrat, il est déplacé à un pK > 9.6, selon le profil de Km en milieu basique. L'inactivation de la chymotrypsine A de porc à pH alcalin reflète un changement conformationnel induit par déprotonation de I1e16 en position N-terminale. La chymotrypsine A de porc montre, dans son expression cinétique, une grande homologie avec les chymotrypsines a- et b- de boeuf.
URI
http://hdl.handle.net/11143/14671
Collection
  • Médecine et sciences de la santé – Mémoires [1598]

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