Séparation, culture et stimulation de lyphocytes humains pour la multiplication du virus de la stomatite vésiculaire

Abstract

La présente étude porte sur la qualité et la reproductibilité des paramètres de séparation et de culture des lymphocytes humains normaux, maintenus en culture de tissus et stimulés par la phytohémagglutinine-P (P,H.A.-P.). Dans ce but, une méthode de séparation et de purification de telles cellules a été mise au point et s'est avérée reproductible quant au rendement en lymphocytes, à la pureté des suspensions cellulaires, à la viabilité et à la transformation des cellules en présence de P. H. A.-P. La méthode de séparation des lymphocytes du sang entier, s'effectue par passage du sang hépariné à travers une colonne de nylon. Cette première étape, étant suivie par la sédimentation à 37°C, du sang éluant, dans du Dextran 6% de P. M. 250, 000. La centrifugation du liquide surnageant constitue la dernière étape de cette méthode, à la fois simple et très convenable pour séparer les lymphocytes, avec un rendement moyen de 42. 5% et une pureté non moins remarquable étant de 98. 6% de lymphocytes par rapport aux leucocytes polynucléaires présents. La détermination de la transformation blastique des lymphocytes cultivés en présence de 25 à 40 µg de P. H. A.-P., a été effectuée à 1, 2, et 3 jours de culture. Le lymphocyte transformé étant une cellule beaucoup plus grosse, possédant un cytoplasme très large parsemé de nombreuses vacuoles; le noyau dont la chromatine est plus "lâche" possède souvent 1 ou 2 nucléoles. Plusieurs formes ainsi caractérisées ont été observées dans nos cultures et évaluées en pourcentage par rapport aux petites cellules normales 2 à 5 fois plus petites qui ne possèdent que très peu de cytoplasme dépourvu de vacuoles. Quelques exemples de cette forme différentiée et jeune du lymphocyte figurent dans les dernières pages de l'appendice. Quant au pourcentage de viabilité et de transformation de ces mêmes cellules cultivées en présence de P. H. A.-P., des valeurs moyennes de 80.7% et de 77.2% ont été obtenues respectivement, après 2 jours de culture. Des calculs statistiques ont permis de démontrer qu'il y avait une différence significative entre le pourcentage de cellules viables dans les cultures de lymphocytes seuls comparativement à celles des lymphocytes en présence de P. H. A.-P. Cette différence existe après 1, 2 et 3 jours de culture. Donc, la P. H. A.-P. (aux concentrations utilisées) semblerait posséder un effet un peu toxique sur les lymphocytes en culture et cet effet se manifesterait dès les premières 24 heures. Cette méthode a également permis d'étudier la multiplication du virus de la stomatite vésiculaire (V.S.V.) dans les lymphocytes et ceci dans des conditions standards de culture et de multiplication virale. Malgré la rigueur de la méthode utilisée et la reproductibilité des paramètres de culture, de viabilité et de transformation, les titres infectieux du virus de la stomatite vésiculaire, se sont avérés peu élevés et très variables d'une expérience à l'autre. Différentes raisons sont évoquées pour expliquer ces résultats; des populations cellulaires hétérogènes, la présence d'interféron, l'inactivation thermique du virus de la stomatite vésiculaire ou une certaine concurrence entre la P.H. A.-P. et le cycle de multiplication virale. Ces études permettent plusieurs explications dont la séparation des lymphocytes en vue de l'obtention d'un sérum anti-lymphocytaire, l'utilisation de ces cellules pour l'étude du mécanisme d'action de certains virus lors de certaines infections virales, la purification d'antigènes membranaires des lymphocytes et finalement elle pourrait constituer un standard de réactivité cellulaire face à l'infection virale puis que le lymphocyte humain n'a jamais été en contact avec V.S. V. qui est un virus animal.