Contribution au développement de l'ultracryotomie : techniques et applications morphologiques et cytochimiques

Abstract

Une méthode simple a été développée pour l'obtention de coupes à congélation ultrafines qui peuvent être obtenues de routine avec un ultramicrotome commercial (Reichert OMU2-Fc15O). Une variété de tissus a été utilisée pour les expériences après une fixation standard de glutaraldéhyde 2.5% tamponnée au cacodylate. Après la fixation, les tissus sont enrobés dans la gélatine a 20% ou simplement supportés par une goutte de méthyle cellulose 3% sur le porte-spécimen: celui-ci est, par la suite, plongé immédiatement dans l'azote liquide. La pyramide est taillée sur place et les coupes à congélation sont effectuées à l'aide de l'avance thermique de l’ultramicrotome en utilisant le diméthylsulfoxide 50% dans l'eau distillée comme liquide de flottaison. Une grande variété de températures pour le spécimen et pour le couteau a été vérifiée: -50°C pour le couteau et -70°C pour le spécimen ont donné les meilleurs résultats. Les coupes sont par la suite recueillies sur des treillis hydrophiles. Trois types de coloration ont été utilisés, le PTA neutre à pH 7.3, le PTA acide à pH 1 et l'acétate d'uranyl aqueuse 0.5% suivi de citrate de plomb. Grâce au méthyle cellulose 3%, les coupes peuvent être effectuées facilement: la préservation est excellente et de faibles grossissements peuvent être obtenus de façon routinière. L'utilisation par comparaison du PTA acide et du PTA neutre montre que le glycogène est préservé au cours de la préparation. Toutes les structures cellulaires contenant des glycoprotéines sont fortement contrastées par le PTA acide. Les réactions d'acétylation et de saponification ont été effectuées et la sélectivité de la coloration au PTA acide pour les glycoprotéines est discutée. Les enzymes endogènes sont également localisées dans les coupes à congélation ultrafines: en tant qu'exemple, la localisation de la phosphatase alkaline dans le rein de rat a été effectuée. Il est également possible de faire des coupes à congélation sans aucune fixation ou uniquement protégées par le glycérol avant la congélation. Les avantages et les limitations de la technique ainsi que ses applications actuelles et futures sont discutées.