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dc.contributor.advisor[non identifié]
dc.contributor.authorBouley, Richard
dc.date.accessioned2018-12-04T20:13:40Z
dc.date.available2018-12-04T20:13:40Z
dc.date.created1993
dc.date.issued1993
dc.identifier.isbn0315931493
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11143/14357
dc.description.abstractLes récepteurs de la vasopressine (VP) ont jusqu'à tout récemment résisté aux efforts multiples d'isolements et de clonages. Un obstacle premier était l'absence de marqueurs sélectifs qui permettent un marquage efficace au préalable à l'isolation de la protéine réceptrice. Nous avons mené une étude de structure-activité d'analogues peptidiques de la vasopressine pour identifier des molécules qui sont à la fois dotées: d'un résidus photo-activable à hauts rendements, d'un résidu pour l'incorporation de l’125I, d'une haute affinité et d'une plus grande sélectivité entre V1 et V2. Parmi ces peptides, nous avons identifié deux analogues prometteurs. Le premier, [B, B dimethyl-B-mercaptopropionyl1, p-benzoylphenylalany2, VaL4, His8, D-tyr9] VP qui a un excellent pKd de 9.6 sur V1 (foie de rat) et un pKd de 6.1 sur V2 (rein de rat). La sélectivité pour le V1 est donc plus qu'un facteur 3000. Le photomarqueur est en position 2 et le site d'iodation est en position 9. Le deuxième peptide, le [B, B- cyclopenta-méthylene-B-mercaptopropionyl1, D-p-benzoylphenylalanyl2, nitrophényl3, Ile4, desGly9] VP démontre un pKd sur V2 de 8.7 et sur V1 de 6.65, donc une sélectivité de 100 fois pour le V2. Le site de radio-marquage est situé en position 3 et se fait par la méthode de Gatterman-Sandmeyer. Le premier analogue a permis d'identifier par photomarquage une protéine de masse moléculaire de 53 kDa et de 43 kDa, après déglycosylation, la masse identifiée correspond au 44.2 kDa déduit de la séquence du récepteur V1. Nos études effectuées avec des photo-marqueurs sélectifs pour les récepteurs de type V1 et V2 de la vasopressine ont été élargies grâce à l'utilisation d'anticorps à haute spécificité pour les récepteurs déjà clônés. Ces anticorps polyclônaux ont été produits par immunisation avec des nonapeptides correspondant à des fragments spécifiques de V1 ou de V2. Les fragments correspondant à des boucles extracellulaires du V1 et du V2 ont été synthétisés: V1 (194 à 203) : V-N- N-G-T-K-T-Q-D-NH2, V1 (324 à 332) : N-F-I-W-T-D-S-E-N-NH2 et V2 (183 à 191): V-G-N-G-S-G-V-F-D-NH2, V2 (297 à 305): P-E-A-P-L-E-R-P-P-NH2. Une immunisation ont été faite avec un mixotope représentant une séquence commune au V1, au V2 et au récepteur de l'oxytocine: V1 (208 à 218) \ V2 (193 à 205) \ OTR (193 à 205) : F-I-Q-P-W-G-(T\P\L)-R-A-Y-NH2. Celle-ci constitue un témoin non-discriminatif qui pourrait permettre éventuellement de déceler d'autres récepteurs de VP qui ne sont pas encore clonés. Les antigènes d'immunisation ont été produits en ajoutant un 3H-Lys additionnel en N-terminal. Les affinités se situaient entre 10 et 10 000 pM pour l'antigène de détection couplé à l'ovalbumine et une absence de réaction croisée indique une haute spécificité. Le buvardage de préparations membranaires hépatiques et rénales de rat confirme que les anticorps reconnaissent sélectivement leurs récepteurs respectifs. Des études d'immunofluorescence et de buvardage sur des cellules rénales humaines permettent de constater que les anticorps se lient sur les récepteurs humains sous leurs formes natives ou dénaturées.
dc.language.isofre
dc.publisherUniversité de Sherbrooke
dc.rights©Richard Bouley
dc.titleSynthèse et développement d'analogues peptidiques photo-activables sélectifs au récepteur V1 ou V2 de la vasopressine et le développement d'anticorps sélectifs anti-V1 et anti-V2
dc.typeMémoire
tme.degree.disciplinePharmacologie
tme.degree.grantorFaculté de médecine et des sciences de la santé
tme.degree.levelMaîtrise
tme.degree.nameM. Sc.


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