Characterization of Zinc Finger Protein 277 and its role in the extra-ribosomal uS5 complex

Abstract

Abstract: Ribosomes, along with their ribosomal (r)-proteins, are mostly known for their capacity to translate mRNA into proteins, yet, thanks to recent advances in the field, we are able to expand our knowledge of this highly complex ribonucleoprotein. In recent years, r-proteins have been reported to form complexes outside of the ribosome that aid in their auto-regulation, the surveillance of ribosome synthesis, and that have been linked to unknown extra-ribosomal functions. For instance, the Ribosomal Protein S2 (uS5) is subjected to arginine methylation by PRMT3 (Protein Arginine Methyltransferase 3), a modification that regulates the physiological functions of proteins and that is evolutionarily conserved from yeast to humans. Unfortunately, to date, PRMT3 is the only know interacting partner of uS5. Using a quantitative proteomic approach in human cells, we were able to get a comprehensive view of the human uS5 protein interaction network. Notably, we identified ZNF277 (Zinc Finger Protein 277) as a new uS5-associated protein. By means of Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays, uS5-ZNF277 complexes were co-localized to both the cytoplasm and the nucleolus. Interestingly, neither of our C2H2-type zinc finger domain proteins (ZNF277 and PRMT3) were found in each other’s pulldown, leading us to speculate that these two proteins form independent uS5-containing complexes. Site directed mutations in ZNF277’s C2H2 zinc fingers confirmed that these motifs are critical for the stable interaction with uS5, as previously shown for PRMT3. Moreover, the over-expression of PRMT3 reduced the formation of ZNF277-uS5 complexes, whereas the depletion of cellular ZNF277 resulted in increased levels of uS5 associated with PRMT3, thus confirming our previous hypothesis. An in vivo RNA co-immunoprecipitation approach revealed that the uS5 mRNA is significantly enriched in ZNF277 precipitates. Although these results suggest that ZNF277 is recruited co-translationally by nascent uS5 via its mRNA, unfortunately, ZNF277 does seem to play a vital role as a dedicated uS5 ribosomal chaperone. Our results have allowed us to further elucidate the role of uS5 outside of the ribosome and the complexity that is the uS5 extra-ribosomal protein interactome.

Résumé : Les ribosomes, ainsi que leurs (r)-protéines ribosomiques, sont généralement reconnus pour leur capacité à traduire les ARNm en protéines. De plus, grâce aux récentes avancées dans le domaine, il est possible d’étendre les connaissances sur cette ribonucléoprotéine hautement complexe. Dernièrement, il a été reporté que les r-protéines forment des complexes en dehors du ribosome. Ces dernières participent à leur auto-régulation, au contrôle de la synthèse des ribosomes et sont associées à des fonctions extra-ribosomales inconnues. Par exemple, la protéine ribosomique S2 (uS5) est sujette à la méthylation de l’arginine par PRMT3 (protéine arginine méthyltransférase 3). Cette modification régule les fonctions physiologiques des protéines et a été conservée dans l’évolution depuis les levures jusqu’aux humains. Néanmoins, actuellement, PRMT3 est la seule partenaire d’interaction connue de uS5. En utilisant une approche protéomique quantitative dans des cellules humaines, il est possible d’obtenir une vue d’ensemble du réseau d’interaction de la protéine uS5. Notamment, on a pu identifier ZNF277 (protéine à doigt de zinc 277) comme nouvelle protéine associée à uS5. Au moyen d’essais de “Bimolecular fluorescence complementation” (BiFC), la colocalisation des complexes uS5-ZNF277 a été observée dans le cytoplasme et dans le nucléole. De manière intéressante, ni ZNF277 et ni PRMT3 (qui possèdent des doigts de zinc de type C2H2) n’ont été retrouvées dans leurs “pulldowns” respectifs. Cela mène à penser que les deux protéines forment avec uS5 des complexes indépendants. Des mutations dirigées dans les doigts de zinc C2H2 de ZNF277 ont confirmées que ces motifs sont cruciaux pour une interaction stable avec uS5, comme montrée précédemment pour PRMT3. De plus, la surexpression de PRMT3 réduit la formation de complexe ZNF277-uS5, alors que la suppression de ZNF277 conduit à une augmentation du niveau de uS5 associée à PRMT3 ; confirmant ainsi l’hypothèse précédente. L’approche par co-immunoprécipitation d’ARN in vivo révèle que le niveau d’ARNm de uS5 augmente significativement dans une purification ZNF277. Aussi ces résultats suggèrent que ZNF277 est recrutée de manière co-traductionnelle sur les nouveaux uS5 via l’ARNm de ces derniers. Cependant ZNF277 ne semble pas jouer un rôle vital de chaperonne ribosomale de uS5. Ces résultats nous permettent de clarifier le rôle de uS5 en dehors du ribosome et la complexité de ses interactions en dehors du contexte du ribosome.