Caractérisation d'un élément intronique réprimant l'épissage et liant la protéine hnRNP

Abstract

Le transcrit primaire codant pour hnRNP A1 est épissé alternativement chez la souris et l'homme. La protéine hnRNPA1b est produite par l'inclusion de l'exon alternatif 7B alors que la protéine hnRNP A1 est produite par l'exclusion de ce même exon. L'intron situé entre l'exon 7 et 7B possède 204 nt. A l'intérieur de cet intron se trouve une séquence de 39 nt qui est conservée à 85% entre la souris et l'humain. Cette conservation inhabituelle d'un élément intronique suggère un rôle dans l'épissage de hnRNP A1. Afin de vérifier cette hypothèse, des RNAs pré-messagers contenant ou non une délétion de 109 nt dans l'intron ont été testés pour leur efficacité d'épissage in vitro. Le RNA ayant subit la délétion est épissé plus efficacement que le RNA original contenant l'intron entier. La substitution des séquences introniques par des séquences de remplissage nous permet de conclure que la stimulation de l'épissage est due à l'absence des séquences introniques et non à la taille réduite de l'intron. La séquence intronique de hnRNP A1 a été insérée dans des introns hétérologues. L'épissage des RNAs faits à partir de ces clones n'est pas inhibé par la présence de la séquence de 109 nt. Afin de déterminer si un facteur lie la séquence de 109 nt, des immunoprécipitations ont été effectuées. Différents anticorps ont été utilisés et seul anti-hnRNP A1 précipite de façon significative le RNA contenant le 109 nt. Des extraits nucléaires de lignées cellulaires exprimant soit hnRNP A1 ou hnRNP A1b ont permis de montrer que hnRNP A1 et hnRNP A1b peuvent chacune lier le RNA du 109 nt. Afin de cerner le site de liaison, des RNAs de différentes tailles ont été soumis à un essai d'immunoprécipitation. Cette étude a permis d'identifier une région de 30 nt nécessaire à la liaison de hnRNP A1. Des expériences de protection à la ribonucléase T1 ont permis de circonscrire une région de 14 nt comme contenant le site de liaison pour hnRNP A1. Des réactions d'épissage du mini-gène contenant la séquence de 109 nt en présence d'excès molaires croissants d'un oligonucléotide contenant le site de liaison à hnRNP A1 n'augmentent pas l'efficacité d'épissage. Il est possible que la liaison de hnRNP A1 dans l'intron séparant les exons 7 et 7B ne soit pas impliquée dans l'inhibition de l'épissage.